各種キナーゼによる分泌応答の修飾とその作用経路のエバネッセント光顕微法による解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10670037
• Research Institution: NIIGATA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 藁科 彬 新潟大学, 医学部, 助教授 (50064580)
• Keywords: クロマフィン細胞 / カテコルアミン分泌 / プロテイン・キナーゼC / ニコチン / ムスカリン / エバネッセント顕微鏡 / アクリジンオレンジ / 開口放出

Research Abstract

副腎髄質細胞の各種刺激による分泌応答に対するプロテイン・キナーゼCの活性化の影響を分析して、以下のような結果を得た。
1.ラット摘出潅流副腎中の髄質細胞を使用し、各種刺激に対する[Ca^<2+>]_i変化(Ca応答)を蛍光指示薬法により、またカテコルアミン分泌変化(分泌応答)を電気化学検出により同時計測した。ホルボル・ジブチレイトによるプロテインキナーゼC(PKC)の活性化は少なくとも2つの異なる経路で分泌応答を修飾することが明らかとなった。即ち、ムスカリン、ブラジキニン、ヒスタミンなど、レセプター/Gタンパク系を介する応答はCa応答が阻害され、分泌応答の抑制を受ける。一方、ニコチンおよび上記の全ての刺激で、Ca応答以後に生ずる分泌を増強する作用が存在した。
2.PKCによる[Ca^<2+>]_i上昇以後の過程における分泌の増強の発生原因を調べるため、エバネッセント光顕微法による細胞膜近傍の分泌顆粒動態の可視化を試みた。半導体グリーンレーザー光を倒立顕微鏡対物レンズの周辺部を通し、細胞チェンバーの底に張ったカバーガラス面で全反射させることにより、カバーガラス面上300-400nmに極限されたエバネッセント光照射場を作った。これにより、細胞膜近傍に存在するアクリジンオレンジで染色した分泌顆粒が細胞の電気刺激により消失する開口放出現象を見ることができた。しかし、研究代表者のICCDカメラでは、分泌顆粒像の取得に0.5秒以上の積算が必要で色素のブリーチングと顆粒の損傷が激しく、顆粒動態の解析が困難であった。しかし、浜松医科大学光量子研(寺川研)との共同研究では、開口放出を準備するため膜に結合する顆粒数がPKCの活性化により増加することが発見された。この結果は、上記のPKCによる[Ca^<2+>]_i上昇以後に発生する分泌増強作用の一つの理由と考えられる。

Research Products

• [Publications] Warashina,A.: "Mechanism of wortmannin-induced inhibition of secretory responses in rat adrenal medullary cells."Life Sciences. 67. 2587-2593 (2000)
• [Publications] Warashina,A.: "Mechanism by which wortmannin and LY294002 inhibit catecholamine secretion in rat adrenal medullary cells."Cell Calcium. (in press).