遺伝子工学的手法によるウィルソン病蛋白ATP7Bの機能ドメインの解析と発症機構

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10670112
• Research Institution: AKITA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 寺田 邦彦 秋田大学, 医学部, 助教授 (60197796)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 相場 なみ子 秋田大学, 医学部, 教務職員 (80210996) ; 杉山 俊博 秋田大学, 医学部, 教授 (00127242)
• Keywords: ATP7B蛋白 / ウィルソン病 / 細胞内銅輸送 / 酵母発現系 / △ccc2株

Research Abstract

[目的]先天性銅代謝異常を示すウィルソン病では銅輸送P型ATPase(ATP7B蛋白)をコードするATP7B遺伝子に様々な変異があることが知られている。ATP7B蛋白には、いくつかの機能ドメインがあると推定されているが、それらが細胞内銅輸送にどのように関わっているかは明らかにされていない。そこで、我々は、ATP7B遺伝子に様々な改変を加え、それらの変異体の機能を酵母発現系で検討し、銅輸送に必須な機能ドメインの構造を明らかにすることを試みた。[研究成果]まず、ATP7B蛋白が持つ機能ドメインの内、銅結合ドメインについて検討した。ATP7B蛋白が持つ6個の銅結合ドメインのうち、1-2番目、1-3番目、1-4番目、1-5番目の銅結合ドメインを持つもの、6番目のみを持つもの、および銅結合ドメインを全く持たない変異体を作製した。次にウィルソン病患者に見られる変異の内、H1069QおよびN1270Sと同様な点変異を持ったcDNAを作製した。さらにATP7B蛋白のC末端側のアミノ酸を様々に欠損させた変異体を作製した。これらのcDNAを酵母の発現ベクターに組み込み、酵母のATP7B相同蛋白であるCcc2蛋白が欠損した酵母株(Δccc2)にリチウム法にで遺伝子導入し、相補試験を行うことによって、それぞれの変異型蛋白の機能を検定した。遺伝子導入されたΔccc2株の内、野生型cDNAを導入されたものと同様に生育できたのは、6番目の銅結合ドメインのみを持つ変異体とH1069Q変異体を発現しているものだけであった。また、C末端側のアミノ酸88個を欠損させると機能を失うことがわかった。以上のことから、ATP7B蛋白が持つ6つの銅結合ドメインの中で6番目のもの、1270番目のアスパラギンを含むドメイン、およびC末端側88個のアミノ酸が、ATP7B蛋白の機能発現にとって重要であることが示唆された。また、N1270S変異体が機能を発現できなかったことは、この変異を持つウィルソン病患者の症状発症を裏付けるものと思われた。

Research Products

• [Publications] Terada K, et al.: "Restoration of holoceruloplasmin synthesis in LEC rat・・・"J. Biol. Chem.. 273. 1815-1820 (1998)
• [Publications] Iida M, et al.: "Analysis of functional domains of Wilson disease protein・・・"FEBS Lett.. 428. 281-285 (1998)
• [Publications] Terada K, et al.: "ATP7B (WND) protein"Int. J. Biochem. Cell Biol.. 30. 1063-1067 (1998)
• [Publications] Mnamiya M, et al.: "The requirement of intercellular adhesion molecule-1・・・"Am.J. Respir. Crit. Care Med.. 158. 635-642 (1998)
• [Publications] Saito H, et al.: "Endothelial myosin light chain kinase regulates neutrophil・・・"J. Immunol.. 161. 1533-1540 (1998)
• [Publications] Schilsky M. L, et al.: "Copper resistant human hepatoblastoma mutant cell lines・・・"Hepatology. 28. 1347-1356 (1998)
• [Publications] Terada K, et al.: "Biliary expression of copper in LEC rat after introduction of・・・"FEBS Lett.. 448. 53-56 (1999)
• [Publications] Terada K and Sugiyama T.: "The Long-Evans Cinnamon rat : An animal model for・・・"Rediatr. Int.. 41. 414-418 (1999)
• [Publications] Narisawa T, et al.: "Inhibitory effects of ursodeoxycholic acid on・・・"J. Exp. Clin. Cancer Res.. 18. 259-266 (1999)
• [Publications] Harada M, et al.: "Wilson's disease gene product, ATP7B, localizes in the late・・・"Gestroenterology. (in press). (2000)
• [Publications] Komatsu M, et al.: "Cisplatin resistance conferred by copper transporting P-type・・・"Cancer Res.. (in press). (2000)