リンパ球アルカリフォスファターゼの分離・精製とリンパ球におけるALP機能の解明

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10670169
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 小野 伸高 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (80233584)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中村 直哉 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (50227922)
• Keywords: アルカリフォスファターゼ / cDNAクローニング / ALP発現ヒトリンパ腫細胞 / ALP-transfected細胞 / クロマトグラフィー

Research Abstract

大量培養されたアルカリフォスファターゼ(以下ALP)を発現するヒトリンパ腫細胞株からイオン交換、ゲル濾過およびハイドロキシアパタイト(以下HA)を用いたクロマトグラフィーによりALPタンパクを精製した。精製したタンパクをcomplete adjuvantとよく混合し、生後6週のメスのマウスの腹腔内に注射、免疫した。初回免疫の2週後に追加免疫を行い、その3日後にマウスNS-1細胞とのFusionを行った。計350個のhybridomaをスクリーニングしたが、ALPタンパクに反応する陽性クローンは得られなかった。そこで現在はマウスを、1)精製ALPタンパクで免疫する、2)ALP発現細胞で免疫する、3)Cyclophosphamideによりマウスを免疫寛容状態にして抗体産生の確率を上げる方法を併用し、抗ALP抗体の作成を再度試みている。また、精製に用いたHAはALPに対しては有効な結果が得られなかったため他の有効なアフィニティー担体を検討中である。
抗ALP抗体の作成と平行して、ALPのcDNAクローニングをRT-PCRを用いて試みる。ALP発現ヒトリンパ腫細胞株からmRNAを作成し、逆転写酵素によりcDNAを作成する。PCRによる遺伝子増幅の際、塩基配列が特定されていないためprimerとして既知の胎盤型、小腸型あるいは肝型ALPの塩基配列から5'側を設定し、3'側は1)5'側と同様に既知の型の3'側の配列を参考にする、2)3'末端の普遍的な配列から決定する。また、cDNAライブラリーを作成し、そこからALPのcDNAをクローニングする方法も併用する。作成されたcDNAは塩基配列の決定、ALPタンパクの一次構造の決定およびALP-transfected細胞を作成し、ALPの機能解明に用いる。