マクロファージ・NK細胞・γδTリンパ球の結核菌によるアポトーシスの研究

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10670542
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 鈴木 克洋 京都大学, 医学研究科, 助手 (00206468)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 孝吉 京都大学, 医学研究科, 助手 (10166796) ; 網谷 良一 京都大学, 医学研究科, 講師 (70167964)
• Keywords: アポトーシス / 末梢血単核球分画 / 単球由来マクロファージ / NK細胞 / 結核菌

Research Abstract

今年度は正常ヒト由来の末梢血単核球分画(PBMC)、半球由来マクロファージ(MDM)、NK細胞のアポトーシスに関する基礎デ一タを作製した。PBMCは末梢血から比重遠心法で採取した。MDMはPBMC中の付着細胞を培養することで形成した。CD56抗体を用い磁気ビーズ法にて陽性選択した細胞をNK細胞と考えた。アポトーシスは全てTUNEL法を用い、FACSCANによるflowcytometryにて定量化した。一部細胞はDAPIを用いた核染色を行い蛍光顕微鏡での観察でアポトーシスの確認を行った。細胞は全て5%ヒトAB型血清加RPMIl640中で培養した。PBMCは2日の培養で7.6%の細胞がアポトーシスを起こしていた。以後経時的にアポトーシス細胞は増加し培養8日めでは61%の細胞に達した。この系に結核菌強毒株H37Rv生菌を感染させるとアポトーシスは抑制され、培養8日目で40%程度に減少した。一方ヒト単球を7日間培養して形成したMDMにH37Rvを5日間感染させたところ、36.5%の細胞がアポトーシスを起していた。これはコントロールの34.7%と同等であった。さらにH37Rv株投与前24時間から各種サイト力インでMDMを活性化したところ、IL-2、TNF-αではアポトーシスの亢進が、一方IFN-γではアポトーシスの抑制が観察された。NK細胞は5日間の培養で約40%がアポトーシスを起こしていた。一方IL-12を投与するとアポトーシスの抑制が観察された。NK細胞にH37Rvを感染させるとコントロールと比べてアポトーシスの亢進がみられた。H37Rvを感染させたNK細胞ではIL-12の前処理をしてもアポトーシスは抑制されなかった。以上の感染実験は全て安全キャビネット内で行い、10%ホルマリンにて1時間処理する事で完全に滅菌した後に各種アッセイを実施した。