ビデオ強化型(VEC-DIC)顕微鏡を用いた培養血管内皮細胞への血小板の粘着・凝集の観察

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10670601
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 棚橋 紀夫 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (10124950)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 富田 裕 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (60276251)
• Keywords: endothelial cell / platelet / adhesion / thrombin

Research Abstract

【目的】ウイルス感染、活性酸素、トロンビンなどにより血管内皮細胞が障害を受けると、血管内皮細胞に血小板が粘着・凝集することが知られている。活性酸素、トロンビンは特に血管閉塞時の二次血栓形成にも関与する可能性がある。今回は、トロンビン刺激後の培養血管内皮細胞と血小板の粘着・凝集の状態をVEC顕微鏡で動的観察し、その定量化を試みた。
【方法】血管内皮細胞(human aortic endothelial cell)を観察用カバーグラス上に,confluentな状態に培養した。観察には倒立型Nomarski顕微鏡、微分干渉対物レンズ、CCDカメラ、画像処理装置からなるVEC-DIC顕微鏡を用い、拡大率3000-8000倍で観察した。また健常人より採血した多血小板血漿(PRP)を作成した。実験(1)トロンビン(human α-thrombin)1.0U/mlを内皮細胞表面上に30分間潅流し、緩衝液にて洗浄、その後、PRPを20分間潅流、再度洗浄後に、血小板の内皮への粘着凝集の状態を観察した(A群:N=10)。
実験(2)トロンビン潅流を行わず、PRPを20分間潅流し同様に観察した(N=5)。
血小板の内皮への粘着・凝集の定量化;程度は30μm x 30μmの区画へ粘着・凝集した血小板の数を各々100区画数え、その平均で評価した。
【成績】A群:トロンビンにより刺激された内皮細胞に血小板が粘着(接着およびその後の扁平化)するのが全例で観察された。粘着した血小板にさらに他の血小板が凝集し、凝集塊が形成される場合も見られた。平均粘着凝集血小板数は11.5±7.6個7900μm^2であった。
B群:内皮細胞への血小板の粘着凝集はきわめて少なく、大きな凝集塊は見られなかった。平均粘着凝集血小板数は0.8±0.6個7900μm^2であり、A群に比較し有意(P<0.01)に少なかった。
【まとめ】(1)トロンビンにより、血管内皮細胞が刺激されると、血小板が内皮細胞に粘着・凝集した。(2)本法は、培養血管内皮細胞と血小板の粘着・凝集過程の動的観察、定量化に有用であると考えられた。

Research Products

• [Publications] Itoh Y,Tomita N,Tanahashi N et al: "Platelet adhesion to Aortic endothelial cells in vitro after thrombin treatment: observation with video-enhanced contrast microscopy" Thrombosis Research. 91. 15-21 (1998)