1998 Fiscal Year Annual Research Report
単純ヘルペス脳炎の診断における定量的化学発光法と定量的PCR法の有用性の比較
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10670608
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
亀井 聡 日本大学, 医学部, 講師 (40142509)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 一史 日本大学, 医学部, 助教授 (50004677)
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| Keywords | 単純ヘルペス脳炎 / 化学発光法 / single PCR / nested PCR |
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| Research Abstract |
[目的]HSVE患者11例,24髄液検体を用い化学発光法により髄液内HSV抗原量,single PCR法(最小検出感度;50Pfu/ml)およびnested PCR法(最小検出感度:20-50 copy/ml)により髄液内HSV-DNA量を定量する。
[方法]化学発光法による髄液内HSV抗原量の測定系:髄液,ルミノール含有medium,血漿,および正常顆粒球浮遊液を37℃でincubateし,抗HSV抗体を加えたassay系を用い、髄液検体の化学発光量をluminescence readerで測定する。この値を、既知ウイルス量から作成した基準曲線により、髄液中のHSV抗原量を測定する。single PCR法による髄液内HSV-DNA定量の測定系:髄液を65℃にて1時間protenase Kを含むlysis bufferで処理し,DNAをphenol-chloroform処理で抽出した。用いたOligonucleotide primersとprobeは、HSV-DNA polymerasegeneより選択した。PCRはdenaturation94℃1分,primer annealing 58℃2分,primer extension72℃2分,40 cyclesでおこなった。増幅DNAは電気泳動で234 bp sequenceで検出した。PCR産物の信号強度をdensitometerで測定し、既知ウイルス量から作成したregression curveから髄液中のHSV-DNA sequence量を定量する。nested PCR法による髄液内HSV-DNA定量の測定系:Kimuraらの方法(KimuraH,et al:J Infect Dis l991 and Ando Y,et al:JMed Virol 1993)に従った。用いたOligonucleotide primersは、polymerase geneより選択した。PCRはdenaturation 96℃l分,primer annealing 67℃2分,primer extension 72℃3分で35cyclesおこなった。増幅DNAはagarose gelに330 bp sequenceで検出した。Southern blotsにおけるPCR産物のradioactivityをimage analyzing systemで測定し髄液中のHSV-DNA sequence量を定量する。
[結果]化学発光法では,l検体(20病日)を除く第3〜25病日の全髄液検体にて50〜48.000 pfu/ml相当の抗原量を検出し得た。single PCRでは6検体において50〜47.000 pfu/mlのゲノム量を検出し得た。nested PCRでは11検体において100未満〜120.000copy/mlのゲノム量を検出し得た。以上の結果から、HSVEにおける全体としての各測定法の感度は症例ベースで化学発光法100%,single PCR36%,nested PCR56%であり、検体ベースで化学発光法88%,single PCR25%,nested PCR52%であった。
[平成11年度の研究計画]非HSVEの患者検体を用い上記3測定法にて検討する。これらの結果から感度の他に、各測定法の特異性,positive predictive value,negative predictive valueについて求め、統計学的に比較検討する。
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[Publications] S.Kamei, T.Takasu, T.Morishima, T.Yoshihara, T.Tetsuka: "Comparison between quantitative detection of intrathecal viral antigen using chemiluminescence and quahtitative detection of intrathecal viral genome sequence using PCR in herpes simplex encephalitis" Journal of the Neurological Sciences. 150(suppl.). S211-S211 (1997)
