1998 Fiscal Year Annual Research Report
内因性肺動脈平滑筋細胞エラスターゼの分子生物学的同定に関する研究
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10670754
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
小林 順 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (20153611)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
薗田 勝 共立女子大学, 家政学部・食物学科, 助教授 (90112648)
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| Keywords | 肺高血圧症 / エラスターゼ / 平滑筋細胞 / 分子生物学 |
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| Research Abstract |
先天性心疾患等に伴う肺高血圧症の成因に、蛋白分解酵素(特にエラスターゼ)が密接に関与していることを、本研究が始まる前に我々は報告した。このエラスターゼは血管平滑筋細胞由来で、従来のエラスターゼとは異なり、発現が微量なため蛋白レベルでの解析は不可能と考え、DNAレベルでの分離同定を本研究の目的とした。まず培養ブタ肺動脈平滑筋細胞(passage2 or3)より、AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法でtotal RNAを抽出した。これをtemplateとして、目的とするエラスターゼcDNAの増幅のため、我々はヒト白血球と膵臓よりのエラスターゼDNAのconservative sequenceより3種類のprimer(primer 1;pELS up(neutro)GCCGCGCACTGCGTG,primer 2;pELS down CAAGGGGCCGCCTGAGTCCCCとprimer3;pELS up(pancreas)CACACGTGTGGCGGTを用意した。primer 1-2,primer 2-3によるRT-PCRのPCR productsは、それぞれ推定で450bpと500bpであるが、実際にはprimer 2-3による284bp PCR productを得た。このDNA sequenceをHomology検索より調べてみると、Homosapiens chromosome 16 BAC clone CIT987SK-44M2と73.4%(overlap252,Score527)の高い一致を見たが、この蛋白がプロテアーゼとは考えられないため、目的とする蛋白のcoding regionではないと判断。再度primerの設計を試みた。今回は宝酒造遺伝子解析センターに依頼しprimer設計を行った。同じくヒト白血球と膵臓よりのエラスターゼDNAのconservative sequenceより4種類のprimer(HUMELAN-250up-CTTCTGGGCAGGAAC-CGTGGGA,HUMELAN-508low-CCTCGGAGCGTTGGATGATAGA,HUMELA3A-473up-CCAACGAGACACCCTGCTACAT,HUMELA3A-784low-TCCAGTCAATGAAGGCGGAGAC)を作成。HUMELANとHUMELA3Aで再度RT-PCRを行う予定である。
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