ジーンターゲティグ法による副腎皮質刺激ホルモン受容体の機能解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10671028
• Research Institution: Hokkaido University of Education
• Principal Investigator: 久保 光正 北海道教育大学, 保健管理センター, 教授 (10205130)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清水 力 北海道大学, 医学部・附属病院, 助手 (00292029)
• Keywords: 副腎皮質刺激ホルモン受容体 / 遺伝子 / ノックアウトマウス

Research Abstract

我々は,マウス副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)受容体遺伝子が4個のエクソンからなり、第1から第3エクソンは5'非翻訳領域を,第4エクソンは5'非翻訳領域の一部と全翻訳領域及び全3'非翻訳領域をコードすることを明らかにした(Gene,1997)。以前からACTHは、ステロイド合成促進作用、脂肪分解作用、中枢神経系に対する作用が知られているが、これらの作用はACTH受容体遺伝子と同時に単離されたメラノコルチン受容体遺伝子がACTH受容体遺伝子と相同性が高いことから両者を介している可能性があり、特に副腎外の作用は、列えばメラノコルチン受容体遺伝子が脂肪組織にも発現していることから、真のACTH受容体の機能を反映しているとは断定できない。今回我々は、ジーンターゲティング法を用いてACTH受容体遺伝子ノックアウトマウスを作製し、その解析から真のACTH受容体の機能を明らかにすべく研究を進めている。はじめに、ACTH受容体遺伝子の第4エクソン内の5'非翻訳領域のPst Iサイトと3'非翻訳領域のSPe Iサイトに挟まれた領域(従って全翻訳領域を含む)をポジティブ選択のためのネオマイシン耐性遺伝子カセットで置換し、次に、Pst Iサイトより1.4kb上流にネガティブ選択のためのジフテリア毒素遺伝子カセットを接続した。3'側の相同領域は翻訳領域の約5.5kb下流のSpe Iサイトまでとした。これをプラスミド(pBluescript II SK-)に挿入することにより、5'側よりジフテりア毒素遺伝子カセット、相同領域(1.4kb)、ネオマイシン耐性遺伝子カセット、相同領域(5.5kb)の順に配列される夕ーゲティングベクターを作製した。これをエレクトロポレーション法にてE14細胞に導入し、G418耐性の細胞クローンを得、現在、PCR法とサザンハイブリダイゼーション法で相同組換えをおこしたクローンをスクリーニング中である。