Two hybrid法を用いた転写因子E1AFのターゲット遺伝子の同定

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10671694
• Research Institution: HOKKAIDO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 進藤 正信 北海道大学, 歯学部, 助教授 (20162802)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安田 元昭 北海道大学, 歯学部, 助手 (90239765) ; 小林 正伸 北海道大学, 医学部・附属癌研究施設, 助教授 (80241321) ; 吉田 幸一 札幌医科大学, 医学部・附属がん研究所, 講師 (60117653) ; 東野 史裕 北海道大学, 歯学部, 助手 (50301891)
• Keywords: E1AF / etsがん遺伝子群転写因子 / 結合タンパク

Research Abstract

前年度作製したE1AFcDNAを酵母転写因子GAL4のDNA結合ドメインとの融合蛋白として発現するようにクローニングしたE1AF発現bait vector pAS1E1AFを用いて、yeast two hybridシステムを用い、結合タンパクの同定を試みた。しかし、酵母内でのタンパクの発現が少なく、転写アクチベーターGAL4adのtagのついたpGAD10に組み込んだヒトcDNAライブラリーとのhybrid形成はほとんど認められず、陽性酵母株の分離は成功しなかった。
このため、フラッグシステムを用いた結合タンパクの解析を試みた。
PCRでFLAGペプチド配列(Asp,Tyr,Lys,Asp,Asp,Asp,Asp,Lys)をもつE1AFcDNAを合成し、真核細胞発現ベクターpCDNA3に組み込み、FLAGE1AF発現ベクターpCDNA3FLAGE1AFを作製した。in vitroでのFLAGE1AF発現を確認後、293細胞に遺伝子導入し、G418セレクションによりstableにFLAGE1AFを発現する293flagFを得た。この細胞を大量培養し、タンパクを抽出し、FLAG抗体を含むアフィティーカラムによりE1AF結合タンパクを分離した。我々が既に報告しているマトリックスメタロプロテアーゼや細胞周期阻害遺伝子/遺伝子産物p21の他に数種類の結合タンパクが分離された。現在、これらのタンパクの解析を行っている。

Research Products

• [Publications] Kaneuchi, M., Yamashita, T., Shindoh, M. et al.: "Induction of apoptosis by the p53-273L (Arg-Leu) mutant in HSC3 cells without transactivation of p21wafI/cipI and bax"Molec. Carcinogenesis. 26. 44-52 (1999)
• [Publications] Kaya, M., Shindoh, M., Higashino, F. et al.: "Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in untreated osteosarcoma is predictive of pulmonary metastasis and poor prognosis"Clin. Cancer Res.. 6. 572-577 (2000)
• [Publications] Shindoh, M., Adachi, M., Higashino, F.et al.: "BAG-1 expression correlates highly with the malignant potential in early lesions (T1 and T2) of Oral Squamous cell carcinoma"Oral Oncol.. (in press). (2000)
• [Publications] Hanzawa, M., Shindoh, M. et al.: "Hepatocyte growth factor apregulates EIAF that induces oral squamous cell carcinoma (SCC) cell invasion by activating matrix metallopreteives genes"Carcinogenesis. 21(in press). (2000)