冷・温阻血傷害肝に産生する一酸化窒素のアンチセンス核酸による抑制

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10672057
• Research Institution: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• Principal Investigator: 土屋 晴嗣 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (90057323)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坂本 宜俊 東京薬科大学, 薬学部, 助手 (60287464)
• Keywords: 一酸化窒素 / 誘導型一酸化窒素合成酵素 / アンチセンス核酸 / ホスフォロチオエート型 / RAW264,7 / クッパー細胞 / 核酸医薬 / 阻血傷害

Research Abstract

研究計画調書に従い,本年度は以下の研究を行った.
1 NIH genetic sequence databaseに登録されているラットiNOSおよびマウスiNOSのmRNA配列を基にDNASIS(日立ソフトウェアー社)を用いてホモロジー検索を行った.それぞれマウスはRAW264.7細胞に,ラットはSDラット肝臓に由来するiNOSmRNA配列を用い検討したところ,79.15%という高いホモロジーが得られた.また,タンパクレベルでの比較では88.99%のホモロジーが得られた.
2 DNASISにより1)で用いたラットiNOSmRNA配列の推定2次構造から,そのループ構造を標的としたホスフォロチオエート型アンチセンスDNA(AS-S-oligo)を5種設計した.AS-S-oligoはそれぞれ,5'非翻訳領域(1種),翻訳領域(3種,うち開始コドン領域に対するもの1種),3'非翻訳領域(1種)に対する20merで,Sugimotoらの最近接塩基対モデルの熱力学的パラメーターから算出したTm値はすべて75℃以上であり,同時に2種類のコントロールS-oligoを設計した.
3 アンチセンス効果を検討するための予備検討として,Kupffer細胞の調製法および種々の刺激物質に対する応答性を確認した.コラゲナーゼ灌流法および振盪法により調製したKupffer細胞を培養プレートに播種し,LPS,TNF-α,IFN-γおよびIL-1βを単独もしくは併用して作用させ,NO産生をGriess法にて確認した.