1999 Fiscal Year Annual Research Report
NAD及びNADP要求性新規ミクロソーム局在アルコール酸化酵素の構造と機能解析
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10672068
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| Research Institution | Hokuriku University |
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Principal Investigator |
松永 民秀 北陸大学, 薬学部, 講師 (40209581)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宇佐見 則行 岐阜薬科大学, 薬学部, 助手 (60257483)
渡辺 和人 北陸大学, 薬学部, 助教授 (30113038)
山本 郁男 北陸大学, 薬学部, 教授 (50069746)
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| Keywords | 7-OH-delta-8-THC / 3-OH-β-ionone / 9-fluorenol / 第2級アルコール / ミクロソーム / 脱水素酸化 / 酸化 / NAD(P) |
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| Research Abstract |
NADのみを補酵素としてビタミンAの構成分子である3-OH-β-ionone(第2級アルコール)のoxo(ケトン)体への酸化反応を触媒する脱水素酵素をニホンザル肝ミクロソームより部分精製した。可溶化剤としてコール酸ナトリウムならびに安定化剤としてグリセロール及びジチオスレイトールを用いたが、初期精製段階において活性の顕著な低下が認められたことから、本酵素は非常に不安定であることが推定された。現在、そのN-末端アミノ酸配列を検討しているところである。また、サル肝9,000xg上清を酵素源としたNADP依存的な酸化活性は、9-fluorenol(122nmo1/min/mg protein)において最も高く、次いでS-indanol(50)、3-OH-β-ionone(15)、R-indanol(7)の順であった。しかし、7α-OH-delta-8-tetrahydrocannabinol(7α-OH-delta-8-THC)、8β-OH-delta-9-THC及び8α-OH-delta-9-THCでは前記基質と比較して極めて低く、特にNADPH依存的反応において高い活性を示す7β-OH-delta-8-THCでは検出限界以下であった。さらに、ヒトの肝あるいはcDNA発現大腸菌より精製されたアルドーケト還元酵素(AKRlC1、1C2、1C3、1C4)のNADP依存的な酸化活性の速度論的解析により、AKRによる3-OH-β-ionone及び9-fluorenolの酸化はAKR1C1の寄与が最も大きいことが示唆された。なお、7-OH-delta-8-THCあるいは8-OH-delta-9-THCに対する酸化活性はいずれの酵素においても非常に低かった。以上の結果より、7-OH-delta-8-THCあるいは8-OH-delta-9-THCの酸化に関しては脱水素酵素の寄与は低いことが示唆された。そこで、7-OH-delta-8-THCからのoxo体生成に関与する主要酵素の精製を行い、サル肝ミクロソームよりP450JM-E(CYP3A8)を得た。また、そのcDNAをクローニングし、精製酵素及び発現酵素を用いて性質を検討した。その結果、本酵素はNADPHのみならずNADHを補酵素とした場合においても高い活性を示し、その補酵素要求性が基質濃度により変化することが明らかとなった。また、ヒトにおいては、CYP3A4が7-OH-delta-8-THCからのoxo体生成に関与する主要な酵素であることを、阻害実験ならびにB-リンパ芽球発現ヒトP450分子種を用いた検討により明かとなった。
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[Publications] K. Watanabe et al.: "Pharmacological effectcs in mice of anandamide and its related ethanolamides, and enhancement of cataleptogenic effect of anandamide by PMSF"Biol. Pharm. Bull.. 22. 366-370 (1999)
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[Publications] N. Usami et al.: "A cytochrome P450 enzyme responsible for carbon monoxide formation by cannabidio] in mouse hepatic microsomes"Res. Commun. Alcohol Subst. Abuse. 20. 69-77 (1999)
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[Publications] T. Matsunaga et al.: "Characterization of microsomal alcohol oxvygenase catalyzing the oxidation of 7-hydroxy-Δ8-tetrahydrocannabinol to 7-oxo-Δ8-tetrahydrocannabinol in rat liver"Biol. Pharm. Bull.. 23. 43-46 (2000)
