病原性真菌アゾール抗真菌剤耐性獲得機構に関する分子レベルでの解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10672081
• Research Institution: Mukogawa Women's University
• Principal Investigator: 吉田 雄三 武庫川女子大学, 薬学部, 教授 (70085281)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 青山 由利 創価大学, 工学部, 助教授 (00158718) ; 工藤 万起子 武庫川女子大学, 薬学部, 副手
• Keywords: 抗真菌剤 / 耐性獲得機構 / P450 / 大腸菌内発現 / フルコナゾール / 病原性真菌

Research Abstract

3年間を予定している本課題研究の2年目に当たる本年度は、前年度の研究方針と成果に基づいて、フルコナゾール耐性カンジダ菌由来の変異CYP51分子と感受性株の2つのCYP51対立遺伝子を個別に大腸菌内で大量に発現させ、発現タンパク質を精製することを試み、以下の成果を得た。
1.フルコナゾール耐性カンジダ由来の変異CYP51遺伝子、感受性カンジダに見出されている2種のCYP51対立遺伝子を個別に大腸菌内で発現させることを試み、何れのCYP51分子種についても安定かつ大量に、大腸菌膜画分内に発現させる条件を確立した。
2.個々の分子種の精製に先立って、大腸菌膜画分に回収されたそれぞれの分子種について、触媒活性、温度安定性、フルコナゾールに対する感受性などを検討した。その結果、大腸菌内に発現させた3種のCYP51分子種がほゞ同じステロール14脱メチル化活性を示すこと、膜に結合した状態での温度安定性に関しても3分子種の間で本質的な差が認められないことを見出した。しかし、フルコナゾールに対する感受性に関しては、感受性株の両対立遺伝子から発現させた分子種間では差が認められなかったものの、耐性変異株の遺伝子から発現させた分子種では予想通りの顕著な感受性の低下を確認した。
3.それぞれのCYP51分子種を発現させた大腸菌膜画分を出発材料として、CYP51の可溶化、精製実験に着手した。カンジダ菌のCYP51のタンパク質化学的な性質がこれまで手がけてきたサッカロミセス酵母や哺乳動物のCYP51のそれとはかなり異なっているらしく、可溶化した状態での安定性の確保、精製に用いるクロマトグラフィー条件などの確立に時間を要したが、最近になって基本的な条件をほゞ確定することに成功した。次年度においては各分子種の本格的な精製と性質の比較実験を行うことを予定している。

Research Products

• [Publications] Asai,K.: "Formation of azole-resistant Candia albicans by mutation of sterol 14-demethylase P450"Antimicrob.Agents Chemother.. 43. 1163-1169 (1999)
• [Publications] Nitahara,Y.: "Purification and characterization of rat sterol 14-demethylase P450(CYP51) expressed in Escherichiacoli"J.Biochem.. 126. 927-933 (1999)
• [Publications] 吉田 雄三: "ステロール14脱メチル化P450(CYP51)に関する最近の話題"日本農芸化学会誌. 73. 1026-1029 (1999)