有害有機化合物分解のためのチトクロームP450遺伝子組込微生物の開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10680546
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 井勝 久喜 岡山大学, 環境管理センター, 助手 (10260663)
• Keywords: チトクロームP450 / 有害有機化合物 / 微生物分解 / 2-エトキシフェノール / 酵素精製

Research Abstract

M9最少培地に8種類のP450誘導剤を単一炭素源として加え,8株のP450産生細菌を分離した。本年度は,新たに有害物質汚染土壌からのP450産生細菌の分離を試み,2-ethoxyphenolを単一炭素源とした培地で9株,2-methoxyphenolを単一炭素源とした培地で5株を分離した。現在,この14株について種々の培養条件におけるP450産生量を測定するとともに,産生されたP450の性質等を調べている。この結果から,P450産生細菌は環境中に広く分布していることが明らかとなり,環境中における有害有機化合物の分解に細菌の産生するP450が関与していることが示唆された。
以前に分離した8株は,それぞれの菌株の分離に使用した誘導剤を単一炭素源とした培地で生育した場合のみP450を産生しており,グルコース等の栄養源が培地に存在しているとP450は産生されなかった。また,P450阻害剤であるmetyraponeを培地に添加し,各株の増殖を検討した結果,栄養培地では増殖量に変化がなかったものの,P450誘導剤を単一炭素源とした培地では明らかに増殖が阻害された。この結果から,これらの株は自身が産生するP450を用いてP450誘導剤を資化し,増殖していることが明らかとなった。
各株の無細胞抽出液を用いて有機化合物の代謝を検討したところ,EP1株の無細胞抽出液が有害有機化合物であるbenzene等及び防菌防黴剤であるpropyl alcohol等を分解したが,他の菌株では分解量が著しく少なかった。代謝再構成系が不完全であった可能性があり,現在EP1株以外の菌株の無細胞抽出液による代謝再構成系を検討している。
8株のP450産生細菌のうちEP1株の産生するP450_<EP1A>を精製した。P450_<EP1A>の分子量は約45kDaであり,N末端アミノ酸配列がRhodococcus rhodochrous116株の産生するP450_<RR1>と類似性が高いことが明らかとなった。現在,EP4株の産生するP450の精製を行っている。

Research Products

• [Publications] Naoko KAWAHARA et al.: "Purification and characterization of 2-ethoxyphenol-induced cytochrome P450 from Corynebacterium sp. strain EP1"Canadian Journal of Microbiology. 45. 833-839 (1999)
• [Publications] 山田浩司 ほか: "環境講座 -環境を考える-"(株)科学新聞社. 326 (1999)