ウミホタル生物発光系の分子機構研究:発光酵素の活性中心の解明

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10680562
• Research Institution: The University of Electro-communications
• Principal Investigator: 丹羽 治樹 電気通信大学, 電気通信学部, 教授 (20135297)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近江谷 克裕 静岡大学, 教育学部, 助教授 (20223951)
• Keywords: ウミホタル / ルシフェリン / ルシフェラーゼ / 生物発光 / 活性中心 / MALDI-MS

Research Abstract

1.千葉県館山沖で採集したウミボタルを使用し、電気刺激法を用いて得たタンパクに対して、硫安沈殿、透析および分子量フィルターを通すことでルシフェラーゼと思われるタンパク質を良い精製度で得ることができた。これにSDS-PAGEによる分子量の確認を行ったところ、およそ68kDaのバンドが検出された。またウミボタルルシフェラーゼ抗体(多クローン抗体)を用いた検出でもこのバンドが確認されたことから、本蛋白がルシフェラーゼである事が示唆された。さらに詳細な分子量を求めるため、MALDI-TOF/MSを用いて測定を行ったところ、62kDa程度のタンパク質であることが判明した。一方、PNGaseF消化を行った後のSDS-PAGEによる分子量測定で、約2〜3kDaのバンドシフトが見られたことから、ルシフェラーゼはN結合型糖鎖を有していると考えられる。現在この糖鎖構造を含めルシフェラーゼの構造確認を急いでいる。
2.ニュージーランドの渓流に棲息する淡水産発光巻貝ラチア(Latia neritoides)はウミボタルと同様、ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応により黄緑色(λmax=536nm)の発光を示す。ルシフェラーゼはレクチンであるコンカナバリンAと親和性があり、PNGaseF消化後、SDS-PAGEにおけるバンドが31kDaから30kDaへシフトした。これらの結果より、ラチアルシフェラーゼはN結合型糖鎖を含むことが示唆された。そこで今だ未知であるラチアルシフェラーゼの構造解析を目的として、ルシフェラーゼを単離・精製しPNGaseF消化後マススペクトロメトリーによる構造解析を行った。単離・精製したラチアルシフェラーゼについてMALDI-TOF/MSを用いて質量分析を行ったところm/z31038にピークを示した。さらに、PNGaseF消化後に同様の測定を行ったところm/z29104にピークを示し、約1930Daの分子量の減少が観測された。この結果より、ラチアルシフェラーゼのN結合型糖鎖は11残基程度の糖鎖であることが判明した。現在、遺伝子の残基配列より求められる推定一次構造の確認や、糖鎖の構造解析を進めている。

Research Products

• [Publications] Jing Ling Zheng: "Synthesis, Chemi- and Bioluminescence Properties, and Photolysis of a Coelenterazine Analogue Having a Photoreactive Azido Group"Bulletin fo Chemical Society of Japan. 73. 465-469 (2000)
• [Publications] Satoshi Kojima: "Bioluminescence Activity of Latia Luciferin Analogs"Tetrahedron Letters. (in press).