1999 Fiscal Year Annual Research Report
筋小胞体カルシウムポンプのリン酸化部位近傍の構造と機能の解析
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10680576
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| Research Institution | ASAHIKAWA MEDICAL COLLEGE |
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Principal Investigator |
大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 助手 (90207267)
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| Keywords | カルシウムポンプ / Ca^<2+>-ATPase / 筋小胞体 / 部位特異的変異 / N末端領域 / 品質管理 / proteasome |
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| Research Abstract |
以前に筆者は、筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(SERCAla)のHis5がリン酸化部位の近傍に存在することを示した。本研究では、N末端領域(Glu2-Alal4)のアミノ酸残基を部位特異的変異により削除あるいは置換した変異体をCOS-1細胞で発現させ、この領域の機能を解析した。
Glu2-Ala4領域の削除変異体のCOS-1細胞での発現はあまり抑制されなかった。しかし、Ala3-Ser6領域の何れか1残基の削除、Ala3-Thr9領域の連続した2残基以上の削除、あるいはA4K、A4D、H5Kの置換によってCOS-1細胞での発現は強く抑制された。1残基の削除変異体ではSERCA1aあたりの特異的Ca^<2+>輸送活性は野生型より僅かに低いだけであった。従って、Ala3-Ser6領域のアミノ酸残基はCa^<2+>輸送に必須ではない。他方、発現が強く抑制された他の変異体では特異的Ca^<2+>輸送活性は強く抑制された。
これらの変異体を犬膵臓ミクロソーム存在下のin vitro発現系で発現させた実験により、COS-1細胞での発現が強く抑制された変異体の転写、翻訳、及び膜への挿入が傷害されていないことことが示された.pulse-chase実験により、発現が強く抑制された変異体のCOS-1細胞内での分解は野生型に比べて非常に速いことが示された。変異体△3のCOS-1細胞での速い分解は、proteasomeの特異的阻害剤であるlactacystinによって強く抑制された。
以上により、SERCA1aのN末端領域(Ala3-Thr9)は小胞体における蛋白質品質管理に感受性が高く、従って、この領域は本蛋白質の正しいfoldingまたは正しくfoldした本蛋白質の安定性(あるいはこれら両方)に重要であることが示唆された。
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[Publications] Takashi Daiho: "Deletions of Specific Substitutions of a Few Residues in the NH_2-terminal Region (Ala^3 to Thr^9) of Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase Cause Inactivation and Rapid Degradation of the Enzyme Expressed in COS-1 Cells"THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 274・34. 23910-23915 (1999)
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[Publications] 大保 貴嗣: "筋小胞体CaD1^<2+>-ATPaseのN末端領域(Ala^3-Thr^9における2-3残基の削除または特異的置換は失活とCOS-1細胞内での速い分解を引き起こす"生化学. 71・8. 933-933 (1999)
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[Publications] 鈴木 裕: "筋小胞体CaD1^<2+>-ATPase1分子あたり1個存在するATP結合部位のうち半数のみがリン酸化中間体を形成する触媒部位である"生化学. 71・8. 644-644 (1999)
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[Publications] Hiroshi Suzuki: "The Na/K-ATPase and Related ATPases"Elsevier,North Holland (K.Taniguchi and S.Kaya Eds.). 8 (2000)
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[Publications] Takashi Daiho: "The Na/K-ATPase and Related ATPases"Elsevier,North Holland (K.Taniguchi and S.Kaya Eds.). 4 (2000)
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[Publications] Kazuo Yamasaki: "The Na/K-ATPase and Related ATPases"Elsevier,North Holland (K.Taniguchi and S.Kaya Eds.). 4 (2000)
