血液凝固系タンパク質のEGF様ドメインに特徴的な糖鎖の合成酵素の精製

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10680582
• Research Institution: Osaka Women's University
• Principal Investigator: 大道 薫 大阪女子大学, 学芸学部, 教授 (90028259)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長谷 純宏 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80028232)
• Keywords: 糖転移酵素 / キシロース転移酵素 / 血液凝固 / EGFドメイン / 糖鎖 / 糖鎖合成 / 合成酵素 / 血液凝固因子

Research Abstract

ウシ肝臓をホモジナイズし,遠心分離による細胞分画を行い,各画分のUDP-D-キシロース:β-D-グルコシドα-1,3-D-キシロシルトランスフェラーゼ(G-酵素)活性の存在を調べた。各画分をキシロースドナーUDP-キシロース(Xyl-UDP)とアクセプター2-[(ピリジル)アミノ]エチルβ-D-グルコピラノシド(Glcβ-EPA)とともにインキュベートし,生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。糖転移生成物Xylα1-3Glcβ-EPAがミクロソーム画分反応混合物中に検出され,G-酵素はミクロソーム画分に存在することが明らかになった。ミクロソーム画分はゴルジ膜の断片を含んでいると考えられ,膜からの可溶化の条件をTriton X-100の濃度を変えて検討した。その結果,1% Triton X-100中,4℃で1時間の処理が適当であった。105,000xgで1時間遠心分離し,その上清(可溶化画分)を粗酵素液とし以下の精製を行った。まず,セファロースCL-6Bカラムでゲル濾過を行い,つぎにUDP-ヘキサノールアミンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行った。この2段階の精製で200倍精製された。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果より,まだ単一な酵素タンパク質でなかったが,この段階で可能な性質を調べた。ゲル濾過の結果より,分子量は約65,000と推定される。示適pHは7.2で,活性の二価カチオン依存性を調べた結果,Mn^<2+>で活性が高かった。Xyl-UDP,Glcβ-EPAに対するKm_<app>値はそれぞれ100μM,18mMであった。