血液凝固系タンパク質のEGF様ドメインに特徴的な糖鎖の合成酵素の精製

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10680582
• Research Institution: OSAKA WOMEN'S UNIVERSITY
• Principal Investigator: 大道 薫 大阪女子大学, 理学部, 教授 (90028259)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長谷 純宏 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80028232)
• Keywords: 糖転移酵素 / キシロース転移酵素 / 血液凝固 / EGFドメイン / 糖鎖 / 糖鎖合成 / 合成酵素 / 血液凝固因子

Research Abstract

前年度,ウシ肝臓をホモジナイズし,遠心分離による細胞分画を行い,ミクロソーム画分にUDP-D-キシロース:β-D-グルコシドα-1,3-D-キシロシルトランスフェラーゼ(G-酵素)が存在することを明らかにし,それを可溶化した.セファロースCL-6Bカラムによるゲルろ過とUDP-ヘキサノールアミンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製をおこなったが,約200倍に部分精製にとどまった.本年度,引き続き精製を進めた.酵素が不安定なため,精製倍率を向上させるには過程の迅速化と精製の効率化を計る必要があると考え,精製の方法や分離モードの異なったクロマトグラフィーをどのように組み合わせて行うかを検討した.まずミクロソーム画分から可溶化したG-酵素を含む粗酵素液をDEAE-セファセルカラムにチャージし,陰イオン交換クロマトグラフィーを行った.酵素活性のある画分を限外ろ過で濃縮し,セファロースCL-6Bカラムを用いてゲルろ過を行った.ついでMono-Qカラムを用いた陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー,UDP-ヘキサノールアミンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを順次行った.これらの4段階のクロマトグラフィーで比活性は3800倍に上昇した.ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果より,まだ完全に単一な酵素タンパク質には精製できていないことが分かったが,基質特異性や性質を調べることや,またG-酵素の活性を示すバンドをゲルより抽出して,そのアミノ酸配列の一部分を決定し,DNAプローブを作成する目的には十分利用できる酵素標品と考えられる.