1999 Fiscal Year Annual Research Report
膜タンパク質の立体構造解析を目指した大量発現系の開発
| Project/Area Number |
10680632
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
杉山 康雄 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70154507)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井原 邦夫 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助手 (90223297)
楠見 明弘 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (50169992)
|
|---|
| Keywords | レチナールタンパク質 / 光駆動イオンポンプ / 異種細胞発現系 / 分裂酵母 / GFP融合タンパク質 / 2次元結晶 / チューブ状構造 |
|---|
| Research Abstract |
1.レチナールタンパク質遺伝子の分裂酵母S.pombeでの発現と発現部位の同定
レチナールタンパク質(bop、aop、及び、hop)遺伝子をPCRで増幅した。それらはN末端にpresequenceをもつもの、成熟タンパク質、C末に(His)6-Tagをもつもの、及び、C末にAequorea victoriaの緑色蛍光タンパク質(GFP)を融合したものである。PCR産物を大腸菌用ベクターと分裂酵母発現ベクターpREP-1へ導入した。分裂酵母発現ベクターで形質転換した酵母細胞をレチナール存在下に培養した。これらはすべて大量に発現できた。蛍光顕微鏡でC末端にGFPを融合した発現タンパク質の所在を追跡したところ、レチナールタンパク質は細胞内膜系に分布しており、現在、発現の経時的パターン変化を追跡している。
2.S.pombeで発現させたレチナールタンパク質の単離精製
分裂酵母で大量発現したレチナールタンパク質を簡便に調製する方法を目指して、 C末に(His)6-Tagを付加した融合タンパク質を発現させてみたが、Ni-NTAアガロースカラム等での精製は容易ではなく、従来の可溶化レチナールタンパク精製法より優れているとは言い難かった。
3.アーキロドプシン(aR)の立体構造変化
aRは細胞膜中で集合して2次元結晶を形成していることが分かった。また、単離したaRを保存すると、膜シートからチューブ状構造へ変換することが分かった。現在、3次元結晶化と構造変化を電顕で観察している。
|
-
[Publications] Kunio Ihara: "Evolution of the archaeal rhodopsins : Evolution rate changes by gene duplication andfunctional differentiation."J.Mol.Biol.. 285. 163-174 (1999)
-
[Publications] Yasuo Mukohata: "Halobacterial Rhodopsins."J.Biochem.. 125. 649-657 (1999)
-
[Publications] Yasuo Sugiyama: "The effect of carboxyl group modification on the chromophore regeneration of archaeopsin-1 and bacterioopsin."J.Biochem.. 125. 1144-1150 (1999)
