1999 Fiscal Year Annual Research Report
ミオシンモータードメイン-GFPキメラ蛋白の1分子機能アッセイ
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10680635
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岩根 敦子 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (30252638)
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| Keywords | ミオシン / グリーン発光蛋白 / 1分子イメージング |
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| Research Abstract |
大腸菌、バキュロウイルスなど従来の遺伝子工学的手法を用いた発現系では機能を保ったまま得ることが困難な骨格筋のミオシン蛋白を緑色蛍光蛋白であるGFP(Green Fluorescent Protein)とのキメラ蛋白として試験管内合成させ、全反射蛍光顕微鏡を用いてこのキメラ蛋白1分子の同定に初めて成功した。さらに、ATPのターンオーバーと言う1分子レベルで蛋白の機能評価を行い、これらの結果は論文に発表した。続いて、この技術を利用して様々な蛍光特性を有する緑色蛍光蛋白変異体であるEYFP並びにイソギンチャクの赤色蛍光蛋白であるDsRedを1分子レベルでのイメージングにも成功した。現在、これらの生物蛍光蛋白を用いてモーター蛋白だけにとどまらずシグナル伝達関連蛋白の機能評価にも応用したいと考えている。標的蛋白は2種類以上の生物蛍光蛋白とのキメラ蛋白として染め分けし、さらに蛍光エネルギー移動法(FRET)等を利用して、蛋白分子内の構造変化や活性化機構の一つと考えられている2量体化を実際に可視し、分子間相互作用を直接調べる試みを行っている。その一例として抗生物質CoumermycinとDNA gyrase BのN末側断片(GyrB)が1:2の割合で結合することを利用し、溶液中でのGyrB-ECFP,GyrB-EYFPの強制的な2量体化形成に伴うFRETの観察に成功。これら生物蛍光蛋白が従来の蛍光色素の代わりに利用できることを明らかにした。さらに生きている細胞内にRaf等のシグナル伝達関連タンパクと生物蛍光蛋白のキメラ蛋白を直接発現させて活性化の機構や細胞内でのシグナル伝達の過程を実時間で観たいと考えている。
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[Publications] T.Yanagida et al.: "Single molecule analysi of the actomyosin motor"Current Opinion in Cell Biology. 12. 20-25 (2000)
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[Publications] T.Yanagida et al.: "Single motor mechanics and models of the myosin motor"The Royal Society Philosophical Transactions B.. 355. 1-7 (2000)
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[Publications] 岩根敦子: "骨格筋ミオシンS1-GFP融合タンパクの試験管内発現と1分子アッセイ"Cytometry Research. 9. 11-20 (1999)
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[Publications] S.Iwatani et al.: "Mechanical and Chemical Properties of Cysteine-Modified Kinesin Molecules"Biochemistry. 38. 10318-10323 (1999)
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[Publications] K.Kitamura et al.: "A single myosin head moves along an actin filament with regular steps of 5.3 nanometres"Nature. 397. 129-134 (1999)
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[Publications] A.H.Iwane et al.: "Single molecular assay of the individual ATP turnovers by a myosin-GFP fusion protein expressed in vitro"FEBS Lett.. 407. 235-238 (1997)
