1999 Fiscal Year Annual Research Report
神経突起の形成過程における選択的蛋白分解の基質蛋白質群の精製と同定
| Project/Area Number |
10680723
|
|---|
| Research Institution | JIKEI UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE |
|---|
Principal Investigator |
高田 耕司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (30179452)
|
|---|
| Keywords | ユビキチン / ユビキチン化蛋白質 / ユビキチン結合酵素 / 蛋白分解 / PC12細胞 / 神経突起 / 精製 / アミノ酸配列 |
|---|
| Research Abstract |
1.精製方法の決定。大量調製が容易なK562細胞を用い、ユビキチン(Ub)化蛋白質の精製法を検討した。その結果、第一段階は抗Ub抗体FK2をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーに決定した。その際、抗体固定化ゲル1mlに約0.2mg Ub当量が吸着し、溶出には3.5M MgCl_2が優れると判明した。この精製標品は、次にSuperdex75のゲル濾過で分画し、30kDaを境とした"高分子量"と"低分子量"のUb化蛋白質画分が得られた。前者は主にマルチUb化蛋白質からなる。後者はUbとチオエステル結合体したUb結合酵素(E2)も含み、E2精製にも有用と判明した。
2.神経突起形成時に特徴的なUb化蛋白質の検出。PC12h細胞を神経成長因子(NGF)存在下で1週間培養した際に出現または増加するUb化蛋白質をFK2抗体による免疫沈降/SDS-PAGEで解析し、前者に3種類(18,19,36-kDa)、後者に6種類(20,23,26,51,68,93-kDa)の候補を見出した。
3.PC12h細胞のUb化蛋白質の精製。NGFで処理したPC12h細胞(2x10^9個)の細胞質抽出液をFK2固定化カラムで精製しUb化蛋白質画分0.56mgを得た後、ゲル濾過で高分子量および低分子量の同蛋白質画分を獲得した。現在、後者の成分をSDS-PAGEで分離し、順次その限定分解産物のアミノ酸配列の同定を進めている。26-kDaバンドに関してはUb部分配列2種類と未知蛋白の部分配列5種類の結果を得た。
4.抗Ub化タグペプチドに対する抗体作成。標的蛋白の同定に不可欠なUb化タグペプチドに対するモノクローナル抗体の作成は、抗原溶解性の問題から困難を極めたが、ペプチドの設計を改良し樹立に成功した。今後この抗体を用いて高分子量Ub化蛋白質の分析を行う計画である。
|
-
[Publications] Ohtani-Kaneko, R.: "Proteasome inhibitors which induce neurite outgrowth from PC12h cells cause different subcellular accumulations of multi-ubiquitin chains"Neurochem. Res.. 23. 1435-1443 (1998)
-
[Publications] Joh, K.: "Isolation and characterization of tubular basement membrane antigen common to human and rats"Int. J. Mol. Med.. 1. 223-226 (1998)
-
[Publications] 高木 優: "アルコール性肝障害における血清ユビキチンの動態について"アルコールと医学生物学. 18. 47-51 (1998)
-
[Publications] Ide, T.: "Ubiquitin stress response in postischemic hippocampal neurons under nontolerant and tolerant conditions"J. Cereb. Blood. Flow Metab.. 19. 750-756 (1999)
-
[Publications] Ohkawa, K.: "Calpain inhibitor causes accumulation of ubiquitinated P-glycoprotein at the cell surface : possible role of calpain in P-glycoprotein turnover"Int. J. Oncol.. 15. 677-686 (1999)
-
[Publications] Takagi, M.: "Serum ubiquitin levels in patients with alcoholic liver disease"Alcohol. Clin. Exp. Res.. 23. 76S-80S (1999)
-
[Publications] Daino, H.: "Induction of apoptosis by extracellular ubiquitin in human hematopoietic cells : possible involvement of STAT3 degradation by proteasome pathway in interleukin 6-dependent hematopoietic cells"Blood. (in press).. (2000)
