電子メディエーター機能を持たせた修飾補酵素による酵素センサーシステムの構築

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10750572
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 木島 龍朗 山形大学, 工学部, 助手 (50272084)
• Keywords: 補酵素 / NAD^+ / メディエーター / フェロセン / サイクリックボルタンメトリー / 酵素センサー

Research Abstract

1. フェロセン修飾補酵素の合成
補酵素NAD^+へ電子メディエーターとしてフェロセンを分子導入するために次のような検討を行った。
(1) NAD^+を無水コハク酸を用いてSuccinyl化し、アミド結合でアデニン環の6-NH2位ヘコハク酸を結合させ、末端をカルボン酸として得た後、アミノ化したフェロセンとDCCによるアミド結合での導入。
(2) NAD^+のアデニン環6-NH2位へ直接フェロセンを導入するため、フェロセンのカルボン酸をハロゲン化し、得られた酸クロライドとNAD^+とを室温にて反応。
(3) (2)におけるNAD^+とフェロセンとの間にスペーサーとしてコハク酸を導入、得られた末端カルボン酸をアミドに変換した後、フェロセンの酸クロライドとの反応。
以上、反応条件、合成ルートなど幾種類もの検討を行ったが、NAD^+ヘフェロセンを分子導入した化合物の合成には至っていない。そこで比較検討のためNAD^+とフェロセンを同じ固定化剤(ポリアクリルアミドゲル)中に閉じ込めただけの非結合型修飾補酵素を合成し、その電気化学的特性を調べた。
2. 補酵素の活性評価
合成された固定化修飾補酵素の活性残存度評価をHLADHによるエタノールの酸化反応系にて行い、NativeなNAD^+を用いた場合と変わらないことを確認した。
3. 電気化学的反応の検討
購入した電気化学分析システム(CS-1090A:東亜電波工業)にて合成された固定化修飾補酵素を用いた反応系のサイクリックボルタンメトリーによる電気化学的特性を調べた結果、酸化還元電位が見られ、補酵素-電極間で電子の授受を行っていることが確認された。しかしその応答性は低く、やはりフェロセンの補酵素への分子導入が必要であると思われる。今後の方針として修飾補酵素の合成において、水溶性DCCによる水系での反応を検討する。またNAD^+ヘフェロセン以外のメディエーターの分子導入も検討してみる。