Brassica rapaの形質転換系の確立および巨大ゲノム断片の導入に関する研究

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10760189
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 柴 博史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (20294283)
• Keywords: 自家不和合性 / BACライブラリー / Brassica rapa / SLG / SRK

Research Abstract

平成10年度はアブラナ科植物B.rapaゲノムDNAのBACライブラリーを作製した。B.rapaS_<12>ホモ系統株由来の核ゲノムを制限酵素HindIIIで部分消化し、100〜150kbのDNA断片を得た後、pBAC-lacベクターのHindIII部位にインサート:ベクター=1:2(モル比)の割合でライゲーションし、大腸菌に形質転換した。得られた白色コロニーのインサートをチェックしたところ、平均70kbのインサートが挿入されていることが分かった。そこでB.rapaのゲノムサイズが約500Mbであることを考慮に入れ、全ゲノムの99.9%以上をカバーする70000クローンからなるBACライブラリーを作製した。また70000クローン中、20000クローンをメンブレン上に固定し、雌しべ側の自家不和合性産物であるSLG遺伝子をプローブにコロニーハイブリダイゼーションを行ったところ、ポジティブクローンが1つ得られた。当該コロニーを解析したところSLG遺伝子は含まれなかったものの、SLG様遺伝子を細胞外ドメインにもつレセプターキナーゼでSLGと同様に自家不和合性因子であることが報告されているSRK遺伝子全長を含む56kbのインサートが導入されていた。平成11年度は上記56kb断片を含むBACクローン中に花粉で発現する遺伝子が含まれているかどうかを明らかにする。またインサート両端に存在する制限酵素NotI部位を用いて56kbのインサートを切り出し、バイナリーBACベクターpBIGRZに導入してAgrobacteriumを用いた遺伝子導入法によりB.rapaおよびアラビドプシスの形質転換体を得る。また解析の終わっていない50000クローンについてもコロニーハイブリダイゼーションを行い、SLG、SRKおよび花粉発現遺伝子を含むクローンを探索する予定である。