糖輸送体の細胞内輸送を制御する分子機構に関する分子細胞形態学的研究

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10770002
• Research Institution: Shizuoka University
• Principal Investigator: 鈴木 雅一 静岡大学, 理学部, 講師 (60280913)
• Keywords: GLUT4 / 3T3-L1細胞 / グルコーストランスポーター / DAMP / FITC-フェリチン

Research Abstract

グルコーストランスポーター4型(GLUT4)を持つ細胞内小胞をキュラクタライズするため、まず3T3-L1脂肪細胞内の小胞のpHをDAMP(3-(2,4-dinitroanilino)-3'-amino-N-methyldipropylamine)を用いて調べた。方法としては、3T3-L1脂肪細胞を10μM DAMPで37℃、30分間処理した後、3%パラホルムアルデヒドにより室温で10時間固定し、連結準超薄切片を作成して蛍光抗体法により観察、解析した。DAMPの蛍光抗体染色によりリソゾームのマーカーであるカテプシンDの分布とよく一致していることが分かった。同様の方法でGLUT4の分布を解析してみると、そのシグナルも細胞質に散在しており、核の近傍に特に強い染色が観察された。GLUT4とDAMPのシグナルは一部重なっていたが、DAMPで濃染された部分にはGLUT4のシグナルは検出できず、GLUT4はリソゾームに存在しないこと、およびGLUT4を持つ小胞のpHは低くないことが示唆された。次に、FITC-フェリチンを液体培地中に、20μg/mlの濃度で加え、1時間と10時間3T3-L1脂肪細胞を培養し、細胞中に取り込まれたフェリチンをエンドソームのマーカーとしてその蛍光とGLUT4との分布を蛍光抗体染色により比較した。トランスフェリンの蛍光は細胞質の表面近傍にドット状に観察されたが、GLUT4との共存は明瞭には検出できなかった。細胞全体に存在するGLUT4の蛍光量から考えると、エンドソームのリサイクリング経路にはGLUT4は少量しか存在していないのかもしれない。