1999 Fiscal Year Annual Research Report
アセチルコリン活性化非選択的カタイオンチャンネルのクローニングと機能発現
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10770020
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
山下 俊一 日本大学, 医学部, 助手 (60256865)
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| Keywords | アセチルコリン / カタイオンチャンネル / 気管平滑筋 / ブタ / クローニング |
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| Research Abstract |
昨年度は、ブタ気管平滑筋から採取精製したpoly(A)^+RNAによりアフリカツメガエルの卵母細胞上にアセチルコリン活性化非選択的カタイオンチャンネル(Ins-ACh)を再構成できることを確認した。そこで、本年度はまずpoly(A)^+RNAを密度勾配遠心法で分画し、Ins-AChが最大となる分画を得た。この分画からcDNAライブラリーを作製し、E.coliに導入した後、in vitro合成されたmRNAを卵母細胞に注入して観察されるIns-AChの有無を示標にライブラリーのスクリーニングを行った。しかしながら、得られたmRNAではIns-AChが全く確認できない、あるいはスクリーニング中にIns-AChを発現するクローンを見失う等の困難が連続した。その度にcDNAライブラリーを作製し直し、新しいデーター取得解析装置(AXON社DigiPack1200)を導入するなどしてスクリーニングの効率化を図った。Ins-AChを発現するクローンを単離する作業は、実験系を改良しながら現在も継続中である。
今後は、得られたcDNAを解析することによりIns-AChの一次構造を決定し、卵母細胞上でキネティクス、Ca^<2+>感受性、チロシンキナーゼ依存性、百日咳毒素感受性について生筋のIns-AChの特性を備えていることを確認してゆく予定である。
本研究の成果はCan.J.Physiol.Pharmacol.に発表した。
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