1998 Fiscal Year Annual Research Report
ピリミジン塩基合成系を標的とする抗トリパノソーマ薬開発モデルの確立
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10770110
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
奈良 武司 順天堂大学, 医学部, 助手 (40276473)
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| Keywords | ピリミジン塩基 / 新生合成 / トリパノソーマ / 薬剤開発 / 組換えタンパク |
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| Research Abstract |
シャーガス病はクルーズトリパノソーマ(Tc)によって引き起こされる疾患であり、現在も有効な薬剤の開発が強く望まれている。本研究では、ピリミジン塩基合成系の初段酵素、カルバモイルリン酸合成酵素(CPSII)を薬剤の標的酵素として想定し、その大量発現及び結晶化を行い、X線解析によりその立体構造を同定後、薬剤スクリーニングのための実験系を確立することを目的とする。本年度はTcCPSIIの大腸菌を用いた大量発現を試み、得られた組換え体CPSIIの酵素学的特徴について検討した。
TcCPSII遺伝子をコードする組換え体プラスミドを作製し、大腸菌を形質転換後、大腸菌内での組換え体TcCPSIIの発現について調べた。大腸菌としては組換え蛋白の高次構造を回復するのに有効であるとされるGroEL、もしくはチオレドキシンを共発現する株か、共発現しない通常の株を用いた。また、CPSIIと同様にピリミジン塩基合成系の第2酵素ACT(TcACT)を大腸菌を用いて発現させ、CPSII活性の測定に用いることとした。最初にTcACTの発現を試みたところ、予想される分子量約36kDのタンパクが得られた。アフィニティーカラムを用いて精製後、組換え体TcACTの酵素学的性状について調べたところ、虫体からの精製標品に比して比活性が高く、基質特異性については天然型酵素と同等であった(投稿準備中)。TcCPSIIについては、N端部のグルタミナーゼ活性を持つ領域を発現させた場合には大量発現が認められたが、全長を発現させた場合にはいずれの菌株を用いた場合でも発現量が極めて少なく、特異的抗TcGAT抗体を用いたウェスタン法によって予想される170kDのTcCPSIIを検出した。現在TcCPSIIの大量発現技術及び精製法の確立を進めると共に、真核生物では初めてとなる第2酵素ACTの結晶化及びX線解析を行っている。
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[Publications] Gao,et al.: "Moleculor characterization of a corbamoyl-phosphate symthetase II (CPS II) gene from Leishmania mexicana" Adv.Exp.Med.Biol.431. 237-240 (1998)
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[Publications] Nara,et al.: "Localization of carbamoyl-phosphato synthetase II (CPSII) and Aspartate carbamoyl transferase (ACT) genes in Trypanosoma cruzi" Adv.Exp.Med.Biol.431. 227-230 (1998)
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[Publications] Nara,et al.: "Carbamoyl-phosphate synthetase II in kinetoplastids" Biochem.Biophys.Acta. 1387. 462-468 (1998)
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[Publications] Chen,et al.: "Molecular cloning and expression of a Schistosoma Japonicum tegumental membrance-associated antigour from Japanese Strain" Parasitol.Int. 47. 289-300 (1998)
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[Publications] Gao,et al.: "Novel organization and segmences of five genes enceding all six enzymes for denovo phrimiding biosynthesis in Tuypanosoma cruzi" J.Mol.Biol.285. 149-161 (1999)
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[Publications] Miyahira,et al.: "Induction of CD8+ T cel-mediated protoctive Iummunity against Tuypanosoma cruzi." Int.Immunol.印刷中.
