1999 Fiscal Year Annual Research Report
アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質の変異導入による機能解析
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10770134
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
卜部 匡司 自治医科大学, 医学部, 助手 (40213516)
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| Keywords | アデノ随伴ウイルス / Rep蛋白質 / 部位特異的組込み / アラニンスキャンニング変異導入 |
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| Research Abstract |
昨年度に実施した、アデノ随伴ウイルス(AAV)のRep蛋白質の変異導入による解析により、細胞毒性が減弱しているEK57AA、RD61AA、R122A、R185A、E201Aの計5クローンを同定した。これら5クローンが本当に野生型Rep蛋白質と同程度のAAVS1特異的組込み活性を保持しているか詳細に調べるため、AAVのinverted terminal repeat(ITR)配列ではさんだNeo遺伝子プラミスドと変異Rep蛋白質発現プラミスドを293細胞にトランスフェクションし、G418存在下で培養を行った。そこから得られたクローンをランダムに拾いそれらのサザン解析を行い、Neo遺伝子がAAVS1領域に組込まれている頻度を検討した。野生型Repを用いた場合は60%(12/20)のクローンでAAVS1特異的組込みが認められ、E201Aを用いた場合、89%(25/28)のクローンでAAVS1特異的組込みが確認できた。一方、その他のEK57AA、RD61AA、R122A、R185Aを用いた場合はAAVS1特異的組込みを示したクローンの頻度は20%以下であった。以上のことは、E201Aが野生型Repと同程度、もしくは、より高い部位特異的活性を保持していることを示しており、細胞毒性が減弱していることと考え合わせ、染色体の特定の部位に任意の外来性遺伝子を導入するテクノロジーにより適している可能性があると考えられる。
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[Publications] Kume,A.: "Hematopoietic stem cell gene therapy : a current overview"Int.J.Hematol.. 69. 227-233 (1999)
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[Publications] Ogasawara,Y.: "Highly regulated expression of adeno-associated virus large Rep proteins in stable 293 cell lines using the Cre/loxP switching system"J.Gen.Virol.. 80. 2477-2480 (1999)
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[Publications] Urabe,M.: "A switching system regulating subcellular localization of unclear proteins using a viral protease"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 266. 92-96 (1999)
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[Publications] Urabe,M.: "DNA/Calcium phosphate precipitates mixed with medium are stable and maintain high transfection efficiency"Anal.Biochem.. 278. 91-92 (2000)
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[Publications] Urabe,M.: "Charged-to-alanine scanning mutagenesis of the N-terminal half of adeno-associated virus type 2 Rep78 protein"J.Virol.. 73. 2682-2693 (1999)
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[Publications] Xu,R.: "A selective amplifier gene for tamoxifen-inducible expansion of hematopoietic cells"J Gene Med.. 1. 224-236 (1999)
