CTGリピート増幅を欠く筋強直性ジストロフィーにおける下流遺伝子発現異常の証明

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10770358
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 津留 智彦 自治医科大学, 医学部, 助手 (90296111)
• Keywords: 筋強直性ジストロフィー / 筋緊張性ジストロフィー / MtPK遺伝子 / MDPK遺伝子 / DMAHP遺伝子 / 発現異常 / 分子遺伝学

Research Abstract

1. CTGリピート伸長のない筋強直性ジストロフィー患者におけるMtPK遺伝子の異常解析
(1) CTGリピート伸長のない筋強直性ジストロフィー患者から採血し、Lymphoprep^<TM>(NYCOMED)を用いてリンパ球を分離し、一部はEBウイルスで株化し、保存。
(2) 分離した患者リンパ球のペレットからEDTA-SDS法によりゲノムDNAを抽出。
(3) PCR法により、MtPK遺伝子のエクソンの全配列を増幅。
鋳型として(2)で抽出したゲノムDNA(1μg)をもちい、酵素はTaKaRa Taq(2.5u)、プライマーはGenome Data BaseのMtPK遺伝子塩基配列から、12エクソンをそれぞれを増幅するように決定し、(株)サワデーに委託して合成。
PCR反応は、すでに有していた、Gene Amp PCR system^<TM>(PERKINELMER)を使用。
それぞれのPCR産物の1/10量をエチジウムブロマイド入り1%アガロースゲル(SEAKEM,FMC)に泳動し、PCR産物の合成を確認。
(4) PCR産物の塩基配列の決定
自動シークエンサーはすでに有していたALF Express^<TM>DNA Sequencer(Amersherm)を使用。
シークエンス反応はThermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with7-deaza-dGTPを用い、キットのプロトコールに従った。
現在、シークエンス進行中であるが、現時点ではCTGリピート伸長のない筋強直性ジストロフィー患者のMtPK遺伝子に欠失、点変異の存在は検出されていない。
2. 筋強直性ジストロフィー患者におけるDMAHPの発現解析
(1) 抗ヒトDMAHP抗体を作成中。