マウスおよびヒト表皮におけるWnt遺伝子の発現、その機能について

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10770397
• Research Institution: 山梨医科大学
• Principal Investigator: 齋藤 敦 山梨医科大学, 医学部, 助手 (30225693)
• Keywords: Wnt-4 / Wnt-12 / RNase protection assay

Research Abstract

我々は、C57/BL6マウスの耳介皮膚よりトリプシンを用いて表皮と真皮を分離、その後表皮細胞のcell suspensionを作製し、さらにRNAZolBにてtotal RNAを抽出、Wnt degenerateプライマーを用いRT-PCRを施行し、PCR産物をクローニングベクター(PbluescriptII)に組み込み、ダイデオキシ法シーケンシングを施行した。その結果、表皮より2種類のWnt遺伝子、Wnt-4とWnt-12をクローニングすることができた。クローニングしたWnt4そして12遺伝子に対して、さらに特異的プライマーを作製し、その発現をRT-PCRで確認したところ、明らかにその発現を認めた。また、mRNAレベルでの発現を確定するために、Wnt-4およびWnt-12の特異的プライマーを用いRNase protection assayを施行したところ、確実に両遺伝子の表皮での発現を確認した。
次に、我々は、Wnt-4遺伝子に注目し、Wnt-4遺伝子の表皮における主たる発現細胞を同定するために、keratinocytes,melanocytesおよび線維芽細胞よりRNAを抽出し、同様にRNase protection assayを施行したところ、keratinocytesとmelanocytesにおいては、Wnt-4遺伝子の発現を認めたが、線維芽細胞においては、その発現を認めなかった。つまり、皮膚におけるWnt-4遺伝子の発現は、表皮特異的であった。
また、in vitroにおいてkeratinocytesのWnt-4遺伝子の発現調節について、Ca^<2+>濃度、各種growth factors(KGF,EGF and HGF)を用いて検討した。その結果、Ca^<2+>濃度の違いにおいては、その発現は、変化が認められなかったが、growth factorと培養したところWnt-4の発現は、明らかに減弱傾向を示した。