Yeast two hybrid法による嚢胞腎起因蛋白に相互作用を有する蛋白解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10770536
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 高橋 真生 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (30297452)
• Keywords: 嚢胞腎 / 酵母 / 結合蛋白

Research Abstract

嚢胞腎は常染色体優性遺伝形式をとり、平成6年にPKDI遺伝子(Polycystin)が責任遺伝子として同定され、PKD2遺伝子は、平成8年に特定された。本研究の目酌はin vivoにおける結合蛋白解析法を用いて、PKDlおよびPKD2遺伝子の関連蛋白のスクリーニングを行い、同定することにある。
本年度はYeast two-hybrid systemの確立と融合蛋白質ライブラリーよりのスクリーニングを行った。
1, まず、PKD1およびPKD2クローン挿入ベクターを構築した。PKD1おおびPKD2のターゲット遺伝子はGALADNA結合領域と融合させ、候補蛋白質をcodingするcDNAライブラリーはGALA転写活性化領域どの融合蛋白質として作成し、Restriction enzyme mappingとシークエンスにて融合プラスミッドの構築が正しいかを確認した。(また、この融合蛋白質(DNA結合領域とターゲット蛋白質)がレポーター遺伝子の転写活性作用がないことを確認する。)
2, 酵母細胞にYeastmaker transfomation systemを利用して、ターゲット融合蛋白質をcodeするプラスミドと活性化領域融合ライブラリーコスミドを導入し形質転換し、形質転換体のβガラクシダーゼ活性をフィルター法で測定する。Two-hybridで再構築された機能的なGALA活性化因子はコロニー青白判定により選択が可能で、本年度は12個の候補クローンを獲得した。偽陽性クローンの排除は、PCRおよび制限酵素切断による陽性クローンをグループ化し、個々のhybridで形質転換を行い、偽陽性の反応をきたさないかどうかを確認する。
3, 今後は、陽性の酵母細胞からのプラスミドDNAの回収を行い、シークエンスで塩基配列を決定しhomologysearchを行う。