原発性甲状腺機能低下症患者から単離された抗TSH受容体自己抗体遺伝子の応用

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10770563
• Research Institution: Research Institute for Production Development
• Principal Investigator: 森山 賢治 財団法人生産開発科学研究所, 研究員 (00301739)
• Keywords: 原発性甲状腺機能低下症 / リコンビナント抗体 / モノクローナル抗体 / TSB-Ab / TBII

Research Abstract

1.TSH受容体抗体産生B細胞クローンの作成と免疫グロブリン遺伝子の単離:原発性甲状腺機能低下症患者の末梢血リンパ球をEB virusでtransformし、培養上清中の抗TSH受容体抗体活性をスクリーニングした結果、IgGB細胞クローン8個クローンを得た。これらのクローンから免疫グロプリン遺伝子をRT-PCRにより単離し、その塩基配列などを解析した。
2.抗TSH受容体抗体の遺伝子工学的再構成とモノクローナル抗体の大量生産:単離・解析した免疫グロブリン遺伝子を、あらかじめ免疫グロブリン遺伝子恒常部を組み込んだ抗体発現ベクター内に再構築し、さらに骨髄腫由来細胞(P3X63-Ag8.653細胞)に導入した。各クローンの培養上清に分泌されたIgG型モノクローナル抗体をProtcinGにてIgGを精製して、IgG量や抗体活性を確認し、TSB-Ab活性に関するスクリーニングを行い32A-5,N-2の2つのクローンを得た。
3.リコンビナント抗体のin vitro,in vivoにおける活性の検討:得れた2つのモノクローナル抗体のうち、まず32A-5に関して再構築した遺伝子をBALB/cマウス骨髄腫由来細胞に導入し恒常的に抗体産生をする細胞株を樹立した。これを同種マウス腹腔に投与し腹水を産生させ回収した。回収した腹水よりProteinAを用いて高濃度かつ高純度のIgGを精製し得た。このモノクローナル抗体を用いてTSB-Ab活性、TBII活性を測定し、それぞれ74.6%(l00μg/mL)、18.48%(100μg/mL)と濃度依存性に有意な活性を有したモノクローナル抗体を生産し得た。今後はN-2クローンに関する活性の検討を行い、更にマウスに投与してin vivoでの生物活性を検討して行く。

Research Products

• [Publications] Akamizu T.,Sale M.M.,Hiratani H.,Miura M.,Saijo M.,Moriyama K.,Noh J.Y.,Rich S.S.,Bowden D.W., and Nakao K.: "Association of autoimmune thyroid disease with microsatellite markers for the thyrotropin receptor gene and CTLA-4 in a new set of Japanese population." Proceeddings of American Thyroid Association. 81- (1998)
• [Publications] Moriyama K.,Akamizu T.,Okuda J.,Miura M.,Saijo M.,Matsuda F.,Mon T.,and Nakao K.: "Preparation and functional analysis of recombinant inhibitory anti-TSH receptor antibodies involved in primary hypothyroidism." Proceddings of American Thyroid Association. 81- (1998)
• [Publications] Akamizu T,Moriyama K,Miura M,Saijo M,Matsuda F,Nakao K: "Characterization of recombinant monoclonal anti-thyrotropin receptor antibodies (TSHRA bs)derived from lymphocytes of patients with Graves disease:Epitope and binding study of two stimulatory TSHRAbs" Endocrinology. (in press). (1999)