おとり遺伝子を用いた血管新生抑制による新規の癌遺伝子治療法の開発と応用

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10771031
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 石橋 浩晃 九州大学, 歯学部, 助手 (90254630)
• Keywords: 腫瘍 / 血管新生 / 遺伝子治療

Research Abstract

現在まで,癌細胞の低酸素培養やTNFα刺激が,転写因子AP-1やSP-1の核内移行を介して,VEGF産生を亢進することをゲルシフトアッセイにより確認した.
そこで,制御する目的転写因子をAP-1およびSp-1とし,おとり遺伝子,すなわちAP-1あるいはSP-1が認識する塩基配列(7塩基)と,その上下流のダミー配列8-10塩基により設計したオリゴヌクレオチドと,それと相補的なオリゴヌクレオチドを合成した.さらにアニールし,HPLC精製により二本鎖合成オリゴヌクレオチドを調製した(以下wild typeと呼ぶ).また,対照としてwildypeから数カ所の配列だけを変異させたmutantypeを調製した.また,HVJ-リポソーム法はウイルスベクターとしてセンダイウイルス(HVJ)を使用した.ニワトリ受精卵にHVJを注射し増殖させるHVJ培養系を確立し,採取した漿尿液からHVJを精製し,凝血活性による力価測定法を樹立した.
さらに,数種類のリン脂質とコレステロールによるリポソームの調製に成功し,HVJ-リポソームの調製法を確立し,90%以上の導入効率を示す導入系を決定した.
そこで,各種培養癌細胞にwild typeあるいはmutant typeのおとり遺伝子を導入し,それぞれ低酸素環境での培養,あるいはTNFαで刺激した細胞のVEGF mRNA発現を検討した.Mutant type導入細胞,Empty HVJ-リポソーム処理細胞は低酸素環境での培養や,TNFα刺激でVEGF mRNAの産生に影響しなかったが,wild type導入細胞は約40%にまで抑制された.また,培養上清中のVEGF量をELISA法で比較検討すると,各おとり遺伝子やEmpty HVJ-リポソームがVEGF mRNA産生に与えた効果と同様の結果を得た.