ディファレンシャルディスプレー法を用いたブレオマイシン肺線維症の分子機構の解明

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10771291
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 熊谷 孝則 広島大学, 医学部, 助手 (70274058)
• Keywords: ブレオマイシン / Differential Display / 遺伝子発現

Research Abstract

ブレオマイシン(Bm)は、扁平上皮癌・精巣癌などに用いられる重要な抗癌剤であるが、長期投与により肺線維症と呼ばれる重篤な副作用を引き起こし易く、その使用には常に制限が伴う。肺線維症に至るメカニズムについては様々な仮説はあるが、その分子レベルでの解明はなされていない。本研究では、肺正常繊維芽細胞株WI-38を用い、Bm投与時に引き起こされる遺伝子発現の変化をDifferentialDisplayの手法により解析し、肺線維症の分子メカニズムの解明を目的とした。
【方法】Bm投与・非投与のWI-38細胞からtotalRNAをそれぞれ調製し、これらを鋳型として、anchor primer(Cy5標識oligo-dT primer)を用いて逆転写反応によりcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型とし、逆転写に用いたanchor primerおよびrandom primerを用いてPCRを行った。それぞれから得られたPCR産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、蛍光イメージアナライザーを用いてバンドパターンを解析した。
【結果】バンドパターン解析の結果、Bm投与により発現の変化する遺伝子が多数見い出された(数十種)。それらバンドをゲルから抽出し、secondPCRにより増幅後、T vectorにサブクローニングした。得られた遺伝子について、DNA塩基配列を決定した結果、細胞骨格系に関与するβ-tublinの他、p53-binding protein,heterogeneous ribonucleoprotein(hnRNP)などの遺伝子が含まれていた。現在、Bm投与が引き起こすこれら遺伝子発現の変化が、どのような役割を果たしているのか解析している。

Research Products

• [Publications] Kumagai,T.: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of bleomycin-binding protein from bleomycin-producing Streptomyces verticillus" Acta Crystallographica Section D. 54. 127-128 (1998)
• [Publications] Kumagai,T.: "Protection of mammalian cells from the toxicity of bleomycin by expression of a bleomycin-binding protein gene from Streptomyces verticillus" Journal of Biochemistry. 124. 835-841 (1998)
• [Publications] Kumagai,T.: "Characterization of the bleomycin resistance determinant encoded on the transposon Tn5" FEBS Letters. 442. 34-38 (1999)
• [Publications] Kumagai,T.: "Crystallization and Preliminary X-ray diffraction studies of bleomycin-binding protein encoded on the transposon Tn5" Acta Crystallographica Section D,. in press.