蛍光標識化DNAを用いた新規な測定法によるRecA蛋白質のDNA組換え反応の解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10780385
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 増井 良治 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (40252580)
• Keywords: RecA蛋白質 / 相同的組換え / DNA結合 / 蛍光標識 / 共鳴エネルギー転移 / 高度好熱菌

Research Abstract

本研究では,複数の蛍光プローブを導入したDNAを用いて,RecA蛋白質によるDNAの相同的組換え反応の経時的な変化を追跡することを目的としている。そこで,まず5'端と3'端をフルオレセインとテキサスレッドでそれぞれ標識したオリゴヌクレオチドと,テトラメチルローダミンで中央の塩基を標識した相補的なオリゴヌクレオチド,各50-merを合成した。また,それぞれについて標識していないオリゴヌクレオチドも合成し,異なる組み合わせの二本鎖DNAを調製した。
まずテトラメチルローダミン標識した一本鎖DNAへの結合に伴う蛍光の時間変化から,大腸菌RecAの一本鎖DNA結合過程を調べたところ,少なくとも二相からなることが分かった。速い相がDNAへの結合を,遅い相がヌクレオプロテインフィラメントの形成を反映するものと考えられた。
次に,大腸菌RecAが結合した一本鎖DNAに二本鎖DNAを加えて,ペアリング反応およびストランド交換反応を観察した。わずかな蛍光変化は観察されたが,共鳴エネルギー転移の効率が低かったため,定量的な解析を行うには至らなかった。現在,蛍光DNAの標識・合成方法をさらに改善している。
一本鎖DNAへの結合過程をさらに詳しく解析するため,高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のRecA蛋白質について,カオトロピックイオンを用いて会合状態を制御することに成功した。その結果を利用して,各会合状態からの一本鎖DNAへの結合過程を調べたところ,いずれの状態からも結合できることが分かった。単量体からでもDNAに結合できることを示したのは,本研究が初めてである。今後は,各会合状態からの結合過程の速度論的解析を行う予定である。

Research Products

• [Publications] 増井良治: "Probing of DNA-binding site of Escherichia coli RecA protein by utilizing 1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid" Biochemistry. 37・42. 14788-14797 (1998)
• [Publications] 増井良治: "Characterization of the oligomeric states of RecA protein:monomeric RecA protein can form a nucleoprotein filament" Biochemistry. 37・35. 12133-12143 (1998)