終脳特異的接着分子テレンセファリンの遺伝子欠損マウスの作成と解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10780477
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 杉野 英彦 理化学研究所, 機能分子研究チーム, 研究員 (70270577)
• Keywords: テレンセファリン(TLN) / キメラマウス / ホモマウス / ヘテロマウス / マイクログリア

Research Abstract

現在までにES細胞(TT2株)由来のDNAから、TLNの全コーデイング領域と5'上流調節領域を含むゲノミッククローンを単離し、制限酵素地図の作成とエクソン/イントロンの位置の決定を行い(Genomics Vol.43:2091997)それらに基ずいて薬剤耐性遺伝子neomycin耐性遺伝子を組み込んだターゲッテイングベクターを作成した。さらに作成したターゲッテイングベクターをES細胞にエレクトロポレーションにより導入し、相同組み替えを起こした6つの独立したmutant ES細胞を上記の薬剤による選択培養で濃縮単離した。これらを正常マウスの8細胞胚に注入し、偽妊娠させた仮親へ戻しキメラマウスの作成を行い5匹のキメラマウスを作成した。このキメラマウスを正常態マウスと交配させ、ヘテロマウスを作成し、そのヘテロマウス同士を交配させ、ホモマウス(ノックアウトマウス、TLN欠損マウス)を作成した。現在までに5匹のホモマウスが生まれている。さらに現在、下記の点に注目してその実験準備を行っている。
1.マイクログリアの活性化
TLN欠損マウスではTLNがないので虚血時でも、マイクログリアの活性化が起りにくいと予想される。そこでHippocompus/Neocortexを中心に野生型マウスと比較する。マイクログリアの形態変化は抗MAC1抗体等を用いて調べる。現在、野生型のマウスを用いてコントロール実験を行っている。
2.神経細胞死の観察
虚血後、appototic neuronの数とnecrotic neuronの数を野生型マウスと比較する。appototic neuronの染色はTUNEL法で行い、necrotic neuronの染色はHematoxylin-Eosin法で行う。
特に海馬CA1領域を中心に遅発性神経細胞死に着目して観察する。これも現在野生型のマウスを用いてコントロール実験を行っている。