肝実質細胞と非実質細胞の混合培養による肝機能の生体外再構築

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10780527
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 三好 浩稔 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (70292547)
• Keywords: 肝細胞 / 胎仔肝細胞 / 血管内皮細胞 / 混合培養 / 3次元培養 / 多孔質樹脂 / oncostatinM / tissue engineering

Research Abstract

本研究では、肝臓の構造を生体外で構築することを目的として、肝細胞と他の細胞との3次元混合培養を行った。3次元培養用の基材として、多孔質のpolyvinyl formal(PVF)樹脂を用い、まず、肝細胞と非実質細胞の混合培養実験を行い、次に胎仔肝臓細胞の培養を行った。
肝細胞と非実質細胞との混合培養実験では、非実質細胞として肝由来非実質細胞(NPC)と血管内皮細胞(EC)の2種類の細胞を用い、約20日間の静置培養を行った。その結果、まず肝細胞のみの培養では、通常の単層培養と比較して3次元培養の方がはるかに安定したアルブミン分泌能を示した。また、NPCとの混合培養ではNPCが肝細胞に及ぼす影響は認められなかったが、ECとの3次元混合培養では、肝細胞のアルブミン分泌能は培養期間を通して徐々に増加した。
次に、増殖性をもつ肝細胞を3次元培養することを目的として、胎仔肝臓細胞の約1ヶ月の長期培養を行った。培地には、肝細胞培養に広く用いられているWE(Williams'E)培地、およびサイトカインの一種であるoncostatin M(OSM)をWEに添加した培地(WE+OSM)を使用した。その結果、WEの場合には細胞数は徐々に減少し、それに伴って肝細胞のアルブミン分泌能も低下したが、3次元培養の方が単層培養よりも活性の維持は良好であった。次に、WE+OSMを用いて培養を行ったところ、特に3次元培養においてOSMの効果が認められた。このとき、細胞数は培養期間を通して増加し、アルブミン分泌能は10倍以上(多いものでは約50倍)に増加した。電子顕微鏡による観察から、これらの培養では細胞は担体上で大きな凝集塊を形成していることがわかった。
以上の結果から、PVF樹脂を担体とする胎仔肝細胞の3次元培養法は、細胞の高密度培養や肝特異的機能の発現に有効であることがわかった。

Research Products

• [Publications] H Miyoshi,K Ookawa,N Ohshima: "Hepatocyte culture utilizing porous polyvinyl formal resin maintains long-term stable albumin secretion activity."J Biomater Sci Polymer Ed. 9(3). 227-237 (1998)
• [Publications] 三好浩稔、大島宣雄: "組織工学的手法によるバイオ人工肝臓の開発"人工臓器. 27(5). 724-732 (1998)
• [Publications] 三好浩稔、大島宣雄: "肝細胞と肝構造の再構築"現代医療. 31(12). 3035-3040 (1999)
• [Publications] 三好浩稔、大島宣雄: "再生医工学技術のバイオ人工肝臓への応用"Pharma Medica. 18(1). 49-55 (2000)
• [Publications] H Miyoshi,T Ehashi,H Ema,HC Hsu,H Nakauchi,N Ohshima: "Long-term culture of fetal liver cells using three-dimensional porous polymer substrate."ASAIO J. (in press).
• [Publications] H Miyoshi,K Ookawa,N Ohshima: "Hepatocyte culture utilizing porous polyvinyl formal resin maintains long-term stable albumin secretion activity.In: Polymers for Tissue Engineering"MS Schoichet,JA Hubbell(Eds),VSP,Utrecht. 11 (1998)