1998 Fiscal Year Annual Research Report
免疫クロブリン遺伝子導入マウスを利用したヒト型高親和性抗体の作製と抗体遺伝子解析
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10877080
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
赤水 尚史 京都大学, 医学研究科, 助手 (20231813)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本庶 佑 京都大学, 医学研究科, 教授 (80090504)
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| Keywords | 免疫グロブリン遺伝子 / TSHレセプター / 抗TSHレセプター抗体 / バセドウ病 / トランスジェニックマウス |
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| Research Abstract |
今回我々は、これらのヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウスを用いて、ヒト型抗TSH受容体抗体の作製と同抗体遺伝子解析を試みることにした。この研究によって、以前困難であつた高親和性ヒト型抗TSH受容体抗体の作製や抗体産主に使用される可変部遺伝子断片を解析の検討を予定している。本年度は、以下の点を研究した。
1. 抗原(TSH受容体)の準備
トランスジェニックマウス疫するTSH受容体蛋白として、バキュロウイルス系のシステムによつて大量発現精製し、これを精製したらすなわち、我々はこれまでに以下の方法によりC末端にHis tagを融合させた可溶型TSHRの作成を行った。すなわちHisを6個コードしているオリゴヌクレオチド及び、それの相補的なオリゴヌ・クレオチドを作成し、これらをアニールさせpBac PAK9トランスファーベクターに組み込んだ。さらにヒトTSHRの細胞外ドメインをコードするcDNAをPCR法により増幅し、His tagを組み込んだトランスファーベクターに組み込み、His thg融合可溶型TSHR cDNAを作成した。そして作成したトランスファーベクターとpBac PAK6ウイルスDNAをSf9昆虫細胞にリポフェクション法によりトラシスフェクトし、これらDNAを昆虫細胞内で相同性組み替えを起こさせ、可溶型TSHRcDNAを組み込んだウイルスを作成した。そのウイルスを夕冫パクの発現量が高いHi five昆虫細胞に感染させ、可溶型TSHRを発現させた。そして発現させた細胞の培養土清画分、細胞抽出画分を作成しHistagを利用したニッケルアフィニティカラムによりそれぞれ精製を行い、可溶型TSHRの発現をウエスタンブロットはより確認した。
2. 抗体遺伝子導入トランズジェニツクマウスの準備
ヒト免疫グロブリン遺伝子導入ゼノマウス(XehoMouse II)供給を日本たばこ産巣(株)医薬研究所・久保田から供給してもらうめどがついた。今後、TSH受容体蛋白をゼノマウスに免疫し、ハイブリドーマ法によるヒト型モノクローナル作製の予定である。
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[Publications] Miyamoto Y,Saito Y,Kajiyama N,Yoshimura M,Shimasaki Y,Nakayama M,Kamitani S,Harada M,Ishikawa M,Kuwahara K,Ogawa E,Hamanaka I,Azuma N,Yoshimasa Y,Yoshimasa T,Itoh H,Masuda I,Yasue H,Nakao I.: "Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension." Hypertension. 32. 3-8 (1998)
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[Publications] Akamizu T,Moriyama K,Miura M,Saijo M,Matsuda F,Nakao K: "Characterization of recombinant monoclonal anti-thyrotropin receptor antibodies(TSHRAbs)derived trom lymphocytes of natients with Graves disease:Epitope and binding study of two stumulatory TSHRAbs." Endocrinology. in press. (1999)
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[Publications] Selliti DF Dennision D,Akamizu T,Koshiyama H: "Thyrotropin receptor(TSHR)in cultured human coronary artery smoothmuscle cells(CASMC)." Proceedings of The Scietific Meeting of the American Society of Hypertension,New York,New York,(abstract). 144A (1998)
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[Publications] Akamizu,M.M.Sale,H.Hiratani,M.Miura,M.Saijo,K.Moriyama,J.Y.Noh,S.S.Rich,D.W.Bowden,K.Nakao.: "Association of autoimmune thyroid disease with microsatellite markers for the thyrotropin receptor gene and CTLA-4 in a new set of Japanese population." Proceedings of The 71th meeting of the American Thyroid Association,Portland,Oregon,(abstract). 80 (1998)
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[Publications] Moriyama,T.Akamizu,J.Okuda,M.Saijo,M.Miura,F.Matsuda,T.Mori,K.Nakao.: "Preparation and functional analysis of recombinant inhibitory anti-TSH receptor antibodies involved primary hypothyroidism." Proceedings of The 71th meeting of the American Thyroid Association,Portland,Oregon,(abstract). 81 (1998)
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[Publications] Akamizu,M.M.Sale,H.Hiratani,M.Miura,M.Saijo,K.Moriyama,J.Y.Noh,S.S.Rich,D.W.Bowden,K.Nakao.: "CTLA-4 is associated with autoimmune thyroid disease in a Japanese population:some alleles mayhave protective effects while others result in disease susceptibility." Proceedings of The second Japan-Korea-China Thyroid Conference,Tokyo,Japan,(abstract). 309 (1998)
