2011 Fiscal Year Annual Research Report
ミトコンドリア内動態制御に基づくミトコンドリア遺伝子発現システムの開発
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10J02273
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
古川 亮 北海道大学, 大学院・生命科学院, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | ミトコンドリア / 遺伝子治療 / 核酸医療 / TFAM / GALA / DDS / ナノテクノロジー / リポソーム |
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| Research Abstract |
生命維持に必須の役割を示すミトコンドリアは様々な疾患と関連しており,そのゲノム異常を治療する遺伝子治療・核酸医薬戦略は難治性疾患治療のブレイクスルーとなる.本研究はミトコンドリアを標的とした遺伝子治療薬・核酸医薬の創出のための基盤技術の開発を最終目的とする.「本年度は,ミトコンドリア標的型リポソーム,MITO-Porterを用いた核酸送達,特にミトコンドリア内での転写活性化を目的としたプラスミドDNAナノ粒子の設計(成果1),およびアンチセンスオリゴRNAのミトコンドリアへの送達(成果2)に取り組んだ.
成果1:ミトコンドリア内での転写活性化を目的としたプラスミドDNAナノ粒子の設計
本研究ではミトコンドリア内での外来DNAの転写活性化を目的としてmtDNAパッケージングタンパク質のMitochondrial transcription factor A(TFAM)(国立精神・神経センター,後藤雄一先生より御供与)に着目し,TFAM-プラスミドDNA複合体の構造が転写に与える影響について評価した.その結果,最適な凝縮化の比率で転写活性化することが示唆された.本研究は既存の遺伝子導入技術にはないミトコンドリア遺伝子治療薬のための基盤技術として有用である.
成果2:アンチセンスオリゴRNAのミトコンドリアへの送達
mtRNAを標的とするアンチセンスオリゴ核酸による標的遺伝子の抑制は,ミトコンドリア核酸医薬へ応用可能であると期待される.機能性素子を検討した結果,エンドソーム脱出素子・GALAを修飾したMITO-Porterを用いることで機能性核酸をミトコンドリアに効率的に送達可能であることが示唆された.さらにアンチセンスオリゴRNAを封入したGALA修飾MITO-Porterは標的mtRNAのノックダウンおよび,ミトコンドリア機能の抑制を誘起する可能性を見出した.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
成果1に関しては今年度に学会で報告済みであり,現在論文を作成中である.当初の計画では今年度はTFAMの生細胞ミトコンドリアにおける転写活性化への寄与について評価する予定であったが,アンチセンス核酸を用いた研究(成果2)が期待以上に進展しているため,本研究に注力した.ベシクルタイプのナノキャリアを用いてミトコンドリアにアンチセンス核酸を送達し,機能を抑制した報告は皆無であり,本研究はミトコンドリア核酸医薬のための基盤技術として非常に有用であると確信している.また,アンチセンス核酸によるノックダウン効率を指標に核酸DDSキャリアとしての改良を行うことで,遺伝子発現のためのキャリア開発にフィードバックすることが可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
成果1に関しては,生細胞系におけるTFAMによる外来遺伝子の転写への影響について評価し,ミトコンドリアを標的とした遺伝子導入技術への有用性について検討する.成果2に関しては,標的遺伝子のノックダウンをRT-PCR,ウエスタンブロッティングを用いて解析する.標的遺伝子抑制に伴うミトコンドリアの機能障害は呼吸活性測定,細胞増殖率測定を用いて評価する.またノックダウン効率の向上のためには,キャリアのミトコンドリアへの移行性を向上させること(細胞内動態の改善),および送達された核酸のミトコンドリアマトリックス内での活性化(ミトコンドリア内動態の改善)の両者が必要である.前者の改善のために,エンドソーム脱出促進を目的としたGALAと共に,ミトコンドリア選択性を有するRNAアプタマーをMITO-Porter表面に修飾することを試みる.後者の改善のためには,ミトコンドリア内部輸送機構を利用する他,TFAMを用いた転写活性化を試みる.
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