In-cell NMRによる細胞内蛋白質の分子動態解析法の研究

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10J05888
• Research Institution: Tokyo Metropolitan University
• Principal Investigator: 濱津 順平 首都大学東京, 理工学研究科分子物質化学専攻有機構造生物化学研究室, 特別研究員(DC1)
• Keywords: In-cell NMR / 蛋白質 / ダイナミクス / Relaxation / 立体構造 / sf9

Research Abstract

(1)異種核多次元NMR法をもちいた生細胞内蛋白質のダイナミクス解析
In-cell NMRにより得られた,大腸菌細胞内におけるTTHA1718蛋白質の^<15>N-T_2緩和時間への化学交換による寄与R_<ex>を明らかするため,TROSY-selected spin-echo実験を行った。R_<ex>はこの実験により得られる交差相関緩和速度定数から算出することができる。
In-cell NMRによりこの実験を行い、得られたデータを解析した結果,in vitro,および in vivoで観測された^<15>N-T_2緩和時間の差異を説明するに足る規模でのR_<ex>は観測されなかった.今後は引き続きこの差異の原因を解明するため,CLEANEX-PM測定による,より広いタイムスケールでのダイナミクス解析を行う.
(2)真核細胞蛋白質大量発現系をもちいたin-cell NMR測定法の確立
本研究では,大腸菌細胞を利用したin-cell NMRにより,世界で初めて細胞内における立体構造決定がなされたTTHA1718蛋白質を目的蛋白質とし、Bac-to-Bac systemにより組み換えバキュロウイルスを作製した。作製したバキュロウイルスを感染させ,細胞内に目的蛋白質を発現したsf9細胞を測定試料とし,in-cell NMRによる2D ^1H-^<15>N HSQC測定を試みた.
TTHA1718蛋白質を発現させたsf9細胞を試料とし,2D ^1H-^<15>N HSQC測定を行った結果,sf9細胞内から目的蛋白質のNMRシグナルの観測に成功した.現在までに,真核細胞内で蛋白質を発現させ,その細胞を測定試料とし多次元NMR測定に成功した例は報告されておらず,本研究結果が第一例目の結果となる.今後は蛋白質主鎖の化学シフトを行うための3次元3重共鳴NMR測定,およびNOESY測定を行い,sf9細胞内での蛋白質の立体構造決定を目指す.

Research Products

• [Journal Article] Exclusively NOESY-based automated NMR assignment and structure determination of proteins (2011)
  • Author(s): Teppei Ikeya, Jun-Goo Jee, Yoshiki Shigemitsu, Junpei Hamatau, Masaki Mishima, Yutaka Ito, Masatsune Kainosho, Peter Guntert
  • Journal Title: Journal of Biomolecular NMR Volume: Online first
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NMR protein structure determination in living E.coli cells using nonlinear sampling (2010)
  • Author(s): Teppei Ikeya, Atsuko Sasaki, Daisuke Sakakibara, Yoshiki Shigemitsu, Junpei Hamatsu, Tomomi Hanashima, Masaki Mishima, Masatoshi Yoshimasu, Nobuhiro Hayashi, Tsutomu Mikawa, Daniel Nietlispach, Markus Walchli, Brian O Smith, Masahiro Shirakawa, Peter Guntert, Yutaka Ito
  • Journal Title: Nature Protocols Volume: Vol.5 No.6 Pages: 1051-1060
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ^<15>N NMR relaxation studies of TTHA1718 protein in living E.coli cells by in-cell NMR spectroscopy (2010)
  • Author(s): 濱津順平, 花島知美, 池谷鉄兵, 三島正規, Daniel Nietlispach, 白川昌宏, 伊藤隆
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会年会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] In-cell NMR法を用いた生細胞内におけるプロテインG B1ドメインの高次構造解析 (2010)
  • Author(s): 花島知美, 浜津順平, 赤羽正寿, 白川昌宏, 三島正規, 池谷鉄兵, Peter Guntert, 伊藤隆
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会年会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] FLYAによる最小スペクトルデータセットを用いた自動構造解析 (2010)
  • Author(s): 池谷鉄兵, 池〓求, 重光佳基, 浜津順平, 三島正規, 伊藤隆, 甲斐荘正恒, Peter Guntert
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-17
• [Presentation] In-cell NMR法を用いた生細胞内におけるプロテインG B1ドメインの高次構造解析 (2010)
  • Author(s): 花島知美, 浜津順平, 池谷鉄兵, 三島正規, Peter Guntert, 白川昌宏, 伊藤隆
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-17
• [Presentation] In-cell NMRによる高度好熱菌TTHA1718蛋白質の生細胞内動態解析 (2010)
  • Author(s): 濱津順平, Daniel Nietlispach, 花島知美, 池谷鉄兵, 細谷沙織, 三島正規, 白川昌宏, 伊藤隆
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-15
• [Presentation] In-cell NMRを用いた生細胞内におけるカルモジュリンN末端ドメインの高次構造解析 (2010)
  • Author(s): 細谷沙織, 濱津順平, 佐々木敦子, 榊原大介, 三島正規, 吉益雅俊, 林宣宏, 伊藤隆
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-15
• [Presentation] STRUCTURE AND DYNAMICS OF PROTEINS AT WORK INSIDE CELLS (2010)
  • Author(s): Y.Ito, J.Hamatsu, T.Hanashima, M.Mishima, T.Mikawa, M.Waelchli, B.O.Smith, M.Shirakawa, T.Ikeya, P.Guentert
  • Organizer: 24^<th> International Conference on Magnetic Resonance for Biological Systems
  • Place of Presentation: Cairns, Australia
  • Year and Date: 2010-08-24