2010 Fiscal Year Annual Research Report
In-cell NMRによる細胞内蛋白質の分子動態解析法の研究
Project/Area Number |
10J05888
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Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
Principal Investigator |
濱津 順平 首都大学東京, 理工学研究科分子物質化学専攻有機構造生物化学研究室, 特別研究員(DC1)
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Keywords | In-cell NMR / 蛋白質 / ダイナミクス / Relaxation / 立体構造 / sf9 |
Research Abstract |
(1)異種核多次元NMR法をもちいた生細胞内蛋白質のダイナミクス解析 In-cell NMRにより得られた,大腸菌細胞内におけるTTHA1718蛋白質の^<15>N-T_2緩和時間への化学交換による寄与R_<ex>を明らかするため,TROSY-selected spin-echo実験を行った。R_<ex>はこの実験により得られる交差相関緩和速度定数から算出することができる。 In-cell NMRによりこの実験を行い、得られたデータを解析した結果,in vitro,および in vivoで観測された^<15>N-T_2緩和時間の差異を説明するに足る規模でのR_<ex>は観測されなかった.今後は引き続きこの差異の原因を解明するため,CLEANEX-PM測定による,より広いタイムスケールでのダイナミクス解析を行う. (2)真核細胞蛋白質大量発現系をもちいたin-cell NMR測定法の確立 本研究では,大腸菌細胞を利用したin-cell NMRにより,世界で初めて細胞内における立体構造決定がなされたTTHA1718蛋白質を目的蛋白質とし、Bac-to-Bac systemにより組み換えバキュロウイルスを作製した。作製したバキュロウイルスを感染させ,細胞内に目的蛋白質を発現したsf9細胞を測定試料とし,in-cell NMRによる2D ^1H-^<15>N HSQC測定を試みた. TTHA1718蛋白質を発現させたsf9細胞を試料とし,2D ^1H-^<15>N HSQC測定を行った結果,sf9細胞内から目的蛋白質のNMRシグナルの観測に成功した.現在までに,真核細胞内で蛋白質を発現させ,その細胞を測定試料とし多次元NMR測定に成功した例は報告されておらず,本研究結果が第一例目の結果となる.今後は蛋白質主鎖の化学シフトを行うための3次元3重共鳴NMR測定,およびNOESY測定を行い,sf9細胞内での蛋白質の立体構造決定を目指す.
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[Journal Article] NMR protein structure determination in living E.coli cells using nonlinear sampling2010
Author(s)
Teppei Ikeya, Atsuko Sasaki, Daisuke Sakakibara, Yoshiki Shigemitsu, Junpei Hamatsu, Tomomi Hanashima, Masaki Mishima, Masatoshi Yoshimasu, Nobuhiro Hayashi, Tsutomu Mikawa, Daniel Nietlispach, Markus Walchli, Brian O Smith, Masahiro Shirakawa, Peter Guntert, Yutaka Ito
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Journal Title
Nature Protocols
Volume: Vol.5 No.6
Pages: 1051-1060
Peer Reviewed
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[Presentation] STRUCTURE AND DYNAMICS OF PROTEINS AT WORK INSIDE CELLS2010
Author(s)
Y.Ito, J.Hamatsu, T.Hanashima, M.Mishima, T.Mikawa, M.Waelchli, B.O.Smith, M.Shirakawa, T.Ikeya, P.Guentert
Organizer
24^<th> International Conference on Magnetic Resonance for Biological Systems
Place of Presentation
Cairns, Australia
Year and Date
2010-08-24