蛋白貭の共同作業による多様な遺伝情報の創出の仕組みとその制御

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11101003
• Research Institution: Iwate College of Nursing
• Principal Investigator: 小川 智子 岩手看護短期大学, 看護学科, 教授 (80028208)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 篠原 彰 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (00252578) ; 塚本 恭正 岩手看護短期大学, 看護学科, 講師 (80341725) ; 小川 英行 岩手看護短期大学, 看護学科, 学長 (70028207) ; 篠原 美紀 広島大学, 原爆放射線医科学研究所・放射線ゲノム学研究, 助手 (80335687)
• Keywords: 減数分裂期組換え / Mre11 / Rad50 / Xrs2複合体 / 制限酵素SceI / Xrs2のドメイン構造 / Xrs2のMre11結合領域 / 組換えDNA修復合成 / Sae2のドメイン構造 / Mre11 / Rad50 / Xrs20複合体foci

Research Abstract

ゲノムDNAの多様化に関与する遺伝的組換えの機能は、細胞内外の要因によるゲノムDNAの切断傷害の修復に関与し、またDNA複製阻害の除去や染色体のテロメア構造の維持にも必須である。われわれが見つけた組換えの中心蛋白質、Rad51やMre11/Rad50/Xrs2蛋白質複合体(MRX複合体)が、どのような仕組みでそれぞれの現象に関与しているかを明らかにして、遺伝情報の安定な維持と多様化の仕組みにおける組換えの総括的な理解を目的としている。
今年度は、1.Mre11複合体の機能制御を行っているXrs2機能ドメインの詳細な解析を行い、(1)Xrs2はC端側に近い、32アミノ酸から成るMBXドメインでMre11に結合し、核内にMre11を移行させる。(2)DNA傷害の修復には、Mre11が核内に移行されていれば、もうXrs2は必要でない。(3)テロメア複製と減数分裂期組換えには、MBXドメインの他に、それに隣接するC端側104、及びN端側49のアミノ酸領域がそれぞれ必要である。2.減数分裂期にMRX複合体のfociが観察ができた。組換え開始DNA二重鎖切断の前に先ずMre11/Xrs2が染色体にリクルートされ、その後Rad50がそこへリクルートされる。3.MRX複合体の機能を制御するSae2の機能ドメイン解析を開始した。この蛋白質がDNA上にfociを形成する事も明らかになった。4.ヒト細胞内でDNA二重鎖切断修復の経過を解析できる系を確立するために、ターゲティング頻度の高いヒトHCT116に、酵母由来の制限酵素I-SceIをエストロゲンの添加で発現できるようにしたプラスミドを導入した。作られた蛋白質は核内に移行していることが間接蛍光抗体法を用いて確認した。5.ユリの減数分裂を誰験館内で進行させ、組換え反応特異的にBrdUの取り込みが検出できる系を確立した。また酵母の系を併用して、組換え時に起きるDNA修復合成の詳細な解析をおこなった。

Research Products

• [Publications] M.Shinohara, Sakai, K., Shinohara, A., Bishop, D.K.: "Crossover interference in Saccharomyces cerevisiae requires a TID1/RDH54-and DMC1-dependent pathway."Genetics. 163. 1273-1286 (2003)
• [Publications] M.Shinohara, Sakai, K., Ogawa, T., Shinohara, A.: "The N-terminal DNA binding domain of Rad52 promotes RAD51-independent recombination in Saccharomyces cerevisiae."Genetics. 164. 855-865 (2003)
• [Publications] Tsukamoto, M., Yamashita, K., Miyazaki, M., Shinohara, M., Shinohara, A.: "The N-terminal DNA binding domain of Rad52 promotes RAD51-independent recombination in Saccharomyces cerevisiae."Genetics. 165. 1703-1715 (2003)
• [Publications] Miyazaki T., Bressan, D.A., Shinohara, M., Haber, J.E., A.Shinohara.: "In vivo assembly and disassembly of Rad51 and Rad52 complexes during double-strand break repair."EMBO. J.23.. 939-949 (2004)
• [Publications] Zierhut, C., Berlinger, M., Rupp, C., Shinohara, A., F.Klein.: "Mnd1 is required for meiotic inter-homolog repair."Current Biology. (in press). (2004)
• [Publications] 篠原 彰, 篠原 美紀: "染色体上でのDNA鎖交換反応-相同組換えの分子メカニズムと細胞機能"細胞工学. 278-282 (2003)