大腸菌を利用した真核細胞由来イオン輸送膜蛋白質の活性発現系の開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11132227
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 魚住 信之 名古屋大学, 生物分子応答研究センター, 助教授 (40223515)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鳥山 尚志 名古屋大学, 生物分子応答研究センター, 教授 (40013338)
• Keywords: Na^+ / K^+ / トランスポーター / AtHKT1 / Arabidopsis / 小麦 / PhoA / 大腸菌

Research Abstract

1小麦Na^+K^+トランスポーター(wHKT1)のホモログ遺伝子をArabidopsisからクローン化して(AtHKT1)大腸菌で発現させた。wHKT1は大腸菌のK^+取り込み変異を相補しなかったが、AtHKT1は相補した。wHKT1が活性発現しなかった理由は明らかではない。次に、PhoAを用いたトポロジー解析を行った。更に、N末端についてはエピトープを導入して膜の内外について検討した。両者の方法からおおよそのトポロジー構造は決定できた。
2マウスCa^<2+>チャネルの膜貫通構造を大腸菌PhoA法によって一部を決定した。
3AtHKT1が発現した大腸菌のK^+取り込み変異株のK^+取り込み活性測定を原子吸光分析法によって測定した。この結果、AtHKT1が発現する大腸菌と相補性を示さない大腸菌のK^+取り込み速度を比較した場合、Km値はほぼ同一であったがVmaxが1.7倍程度大きくなっていた。一方、昨年度、植物K^+チャネル(KAT1およびAKT2)はK^+取り込み能を欠損した大腸菌を相補することを見いだしたが、K^+の取り込みは測定できなかった。パッチクランプ測定可能な大きさに大腸菌を巨大化し、大腸菌の細胞膜を対象に電気生理学的手法でK^+電流を測定することを試みた。K^+電流が観察されたが、今後、本電流はKAT1由来であることを数多くの実験で検証する必要があると考えている。

Research Products

• [Publications] UOZUMI et al.: "The Arabidopsis HKT1 gene homologue mediates in ward Na^+ currents in Xenopus oocytes and Na^+ uptake in Saccharomyces cerevisiae"Plant Physiology. (in press). (2000)
• [Publications] 中村辰之助、魚住信之: "動植物と細菌のカチオン輸送系の接点"蛋白質核酸酵素. 44・13. 1988-1995 (1999)
• [Publications] 魚住信之: "真核生物のイオン輸送体を大腸菌で解析する"生物工学会誌. 77・12. 502-505 (1999)