重金属を選択的にターゲティングするタンパク質分子のデザイン

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11132246
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 山下 光雄 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (40220347)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小野 比佐好 遺伝情報実験施設, 助手 (40224274) ; 室岡 義勝 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (60029882)
• Keywords: 重金属 / メタロチオネイン / タンパク質工学 / SH基高含有タンパク質 / 重金属結合タンパク質

Research Abstract

特定の重金属を識別する金属タンパク質を創製し、重金属解毒等の医療医薬に、又は環境中の重金属モニターとして集積除去に関わる新素材としての機能を開発することを目的に、下記の研究を行った。
1)三次構造モデルの構築と重金属特異的結合能を有するタンパク質の開発:
コンピューターグラフィックにより立体構造を解析した。
2)重金属ターゲティングのための新規金属選択性タンパク質のデザイン:
システィンを含む他のアミノ酸を上記構造モデルより予測して、C7S,C19H,C26H,C29H,K31A,C48Hの変異メタロチオネイン遺伝子を得た。
3)重金属結合タンパク質の発現生産効率評価のための簡易測定法の開発:
新たにインテイン融合ヒトメタロチオネインタンパク質を生産後、目的タンパク質を精製し、原子吸光光度計により重金属結合量を測定し、1モルタンパク質あたり72カドミウム原子の結合能を得た。抗ウサギメタロチオネインマウスモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果、4量体メタロチオネインは本抗体と交差性が認められた。
4)リニューアルメタロプロテインの生化学的諸性質の測定:
部位特異的変異法により置換した変異遺伝子を発現ベクターに再構築し宿主菌に導入した。大腸菌による重金属結合タンパク質の発現生産系を基に、それぞれリニューアルメタロプロテインを大量生産した。目的タンパク質を精製し、原子吸光光度計により重金属結合量を測定し、C19H,C29H,C48Hの1モル変異メタロチオネインに対して7.7,7.8,7.0カドミウム原子の結合能を得た。

Research Products

• [Publications] S. Nishikawa: "Rhodobacter sphaeroides mutants which accumulate 5-aminolevulinic acid under aerobic and dark conditions"Journal of Bioscience and Bioengineering. 87(6). 798-804 (1999)
• [Publications] 山下光雄: "有用酵素タンパク質の機能改良に関する研究"生物工学会誌. 77(8). 345-357 (1999)
• [Publications] 西矢芳昭: "機能改変コレステロールオキシダーゼの開発と応用"生物工学会誌. 77(10). 429-432 (1999)
• [Publications] Yoshinobu Kaneko: "Development of a host-vector system for Lactobacillus plantarum L137 isolated from a traditional fermented food produced in the Philippines"Journal of Bioscience and Bioengineering. 89(1)(印刷中). (2000)
• [Publications] S. -H. Hong: "Molecular design of novel metal-binding oligomeric human metallothioneins"Applied Microbiology and Biotechnology. (印刷中). (2000)
• [Publications] H. Nakayama: "Ectoine, the compatible solute of Halomonas elongata, confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells"Plant Physiology. (印刷中). (2000)
• [Publications] M. Yamashita: "Isolation, characterization, and molecular cloning of a thermostable xylitol oxidase from Streptomyces sp. IKD472"Journal of Bioscience and Bioengineering. 89(1)(印刷中). (2000)