1999 Fiscal Year Annual Research Report
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11146210
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
増井 良治 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (40252580)
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| Keywords | RecA / 相同的組換え / 共鳴エネルギー転移 / 蛍光DNA |
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| Research Abstract |
遺伝情報の編成やDNA修復において重要である相同的組換え反応は,細菌ではRecA蛋白質が担っている。組換え反応の全容解明には,各々の素反応の詳細な解析,特に速度論的な解析が必要である。しかし,RecAの場合,反応過程を経時的に研究した報告はほとんどない。本研究では,複数の蛍光プローブを導入したDNAを用いて,蛍光の共鳴エネルギー転移を利用したDNA鎖の相互の配置の動的変化すなわち組換えの速度を推定し,組換え反応過程の経時的な変化を追跡することを試みた。まず,標識可能なアミノ基やチオール基を持つデオキシヌクレオチドを用いて二種類の蛍光標識化DNA(50-mer)を人工的に合成した。一方は分子中央にテトラメチルローダミン(R)を,もう1つは5端にフルオレセイン(F),3'にテキサスレッド(T)を導入した。大腸菌RecA蛋白質は,すでに構築してある大量発現系を用いて調製した。次に,R一本鎖DNAとRecAの相互過程を蛍光スペクトルを用いて測定したところ,少なくとも2つの結合相が観察された。このR-一本鎖DNA-RecA複合体にF/T-二本鎖DNAを加え,Rの励起光で励起したところ有意な蛍光スペクトル変化が見られた。反応前後の差スペクトルは,ほぼTのものに相当した。さらに,Tの蛍光波長で時間変化を測定したところ,大きく2つの相が見られた。このように,今回構築した測定系でRecA-一本鎖DNA複合体と二本鎖DNAとのペアリング反応を,蛍光エネルギー転移を利用して実際に測定できることが示された。
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Research Products
(6 results)
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[Publications] 増井良治: "好熱菌の全ゲノム配列決定とその意義"蛋白質 核酸 酵素. 44(2). 165-170 (1999)
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[Publications] Shibata Akihiko: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a DNA excision repair enzyme, UvrB, from Thermus thermophilus HB8"Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.. 55(3). 704-705 (1999)
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[Publications] Noriko Nakagawa: "Crystal structure of Thermus thermophilus HB8 UvrB protein, a key enzyme of nucleotide excision repair"The Journal of Biochemistry. 126(6). 986-990 (1999)
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[Publications] Yuri Kil: "Efficient strand transfer by the RadA recombinase from the hyperthermophilic archaeon Desulfurococcus amylolyticus"Journal of Bacteriology. 182(1). 130-134 (2000)
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[Publications] Maria Spies: "The RadA protein from a hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum islandicum is a DNA-dependent ATPase that shows two disparate catalytic modes, with a transition temperature at 75℃"European Journal of Biochemistry. 267(4) (in press). (2000)
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[Publications] Atsushi Yamagata: "Interaction of UvrA and UvrB proteins with a fluorescent single-stranded DNA"Journal of Biological Chemistry. 275 (in press). (2000)
