1999 Fiscal Year Annual Research Report
自然突然変異抑制に働く8-oxo-dGTPaseの3次元構造に基づく機能解明
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11146211
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山縣 ゆり子 大阪大学, 薬学研究科, 助教授 (40183678)
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| Keywords | 8-oxo-dGTPase / MutT蛋白質 / X線結晶構造解析 / MutT-8-oxo-dGMP複合体 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、活性酸素がdGTPと反応し生じる変異原性ヌクレオチド8-oxo-dGTPを8-oxo-dGMPに分解し、ヌクレオチドプールを浄化する大腸菌とヒト由来の8-oxo-dGTPase(MutTとhMTH1)、および、それらと基質アナログ複合体のX線結晶構造解析を行ない、原子レベルで8-oxo-dGTPの認識機構、リン酸ジエステル結合切断機構を解明することである。
大腸菌MutTフリーについては、白金誘導体を用いた重原子同型置換法で解析、得られた電子密度から3次元構造モデルの構築を試みていたが、全領域のモデル構築に成功しなかったので、引き続き、別の重原子誘導体の検索を行った。結晶に約30種の重原子をsoakingし、それら重原子誘導体結晶のX線回折データを主に、高エネルギー加速器研究機構の放射光(PF)ビームラインBL18Bで測定したところ、さらにカドミニウムや水銀の重原子誘導体が位相決定に寄与することがわかり、現在これらの重原子誘導体結晶のデータを加えて解析、得られた電子密度から3次元構造モデルの構築を試みている。MutT-Mn^<2+>複合体については、MutTフリーの構造が解け次第、分子置換法で解析し、Mn^<2+>(Mg^<2+>と同じと考えられる)の結合様式を決定する。基質アナログ複合体については、基質アナログのsoakingを行う予定である。
hMTH1の大量発現ベクターを組み込んだ大腸菌(九州大学中別府教授から供与された)を培養、大量生産させ、高純度で精製した。hMTH1の3次元構造については、奈良先端科学技術大学院大学白川博士らとの共同研究でNMRでの解析が進行している。
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[Publications] Kazufumi Takano: "Contribution of Hydrogen Bonds to the Conformational Stability of Human Lysozyme : Calorimetry and X-ray Analysis of Six Serine -> Alanine Mutants"Biochemistry. 38. 6623-6629 (1999)
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[Publications] Kazufumi Takano: "Experimental Verification of the 'Stability Profile of Mutant Protein' (SPMP) Data Using Mutant Human Lysozymes"Protein Engineering. 12. 663-672 (1999)
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[Publications] Kazufumi Takano: "Contribution of Intra-and Intermolecular hydrogen Bonds to the Conformational Stability of Human Lysozyme"Biochemistry. 38. 12698-12708 (1999)
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[Publications] Jun Funahashi: "Contribution of Amino Acid Substitutions at Two Different Interior Positions to the Stability of Human Lysozyme"Protein Engineering. 12. 841-850 (1999)
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[Publications] Kazufumi Takano: "Effect of Foreign N-terminal Residues on the Conformational Stability of Human Lysozyme"Eur. J. Biochem.. 266. 675-682 (1999)
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[Publications] Shuichiro Goda: "Amyloid Protofilament Formation of Hen Egg Lysozyme in Highly Concentrated Ethanol Solution"Protein Science. 9. 381-388 (2000)
