1999 Fiscal Year Annual Research Report
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11153206
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 尊雄 海洋バイオ研究所, 釜石研究所, 研究員
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| Keywords | 分子シャペロン / シャペロニン / 古細菌 / 超好熱菌 / フィラメント / プレフォルディン / sHsp / Thermococcus' |
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| Research Abstract |
超好熱性古細菌 Thermococcus strain KS-1 由来シャペロニンのα,βサブユニットは非常に高い相同性を有しているが,C末端のみ相同性が低い.このC末領域のペプチドを抗原として,各サブユニットに特異的な抗体を作成し,Western Blotting及びELISAにより,菌体内における各サブユニットの量を定量した.その結果,Thermococcus菌体内のシャペロニンでは,生育温度によりオリゴマーのサブユニット組成が異なり,αとβサブユニットのそれぞれが個別に発現制御されていることを明らかにした.αの発現は構成的であり,高温でも発現量は変化しない.一方,βは至適生育温度前後ではαよりも少ないが,温度が上がるに従って発現量が多くなった.また,αホモオリゴマーとβホモオリゴマーの結晶化を試み,αホモオリゴマーの結晶が得られた.
T.KS-1のsHspを大腸菌で生産し,その特性を調べた.組換えT.sHspは精製が不十分な状態ではタンパク質の変性中間体に結合する活性はほとんどなかったが,精製度を上げると活性が確認され,Thermoplasma由来Citrate synthaseの熱変性による凝集を防いだ.T.sHspはホモオリゴマーを形成し,その分子量を光散乱法により測定したところ478.6kDaであった.塩基配列から予想されたモノマーの分子量は20kDaであることから24量体であることが予想された.Methanococcus jannashiiのsHspは、結晶構造解析の結果,24量体のサッカーボール型であることが分かっているが,T.sHspも同様な構造を形成していることが示唆される.電子顕微鏡による解析結果もサッカーボール型であることが支持している.
また,Pyrococcus horikoshii OT3の2つのPrefoldin遺伝子を大腸菌に組み込む,発現系を構築した.
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[Publications] Teshima. T., et al.: "Preparation of Thermus thermophilus Chaperonin Immobilized Microspheres with High Refolding Activity and High Stability"Biotechnology and Bioengineering. (in press).
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[Publications] Teshima. T., et al.: "Affinity Purification of Fusion Chaperoning Cpn 60-(His)6 from Thermophilic Bacteria Bacillus Strain MS and Hs' Use in Fascilating Protein Refolding and Preventing Heat Denaturation"Biotechnology Progress. (in press).
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[Publications] Motohashi, K., et al.: "Heat Inactivated Proteins are Rescued by the DrakJ-Grp E Set and C/pB Chaperones"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96. 7184-7189 (1999)
