1999 Fiscal Year Annual Research Report
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11155209
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| Research Institution | Tokyo Gakugei University |
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Principal Investigator |
原田 和雄 東京学芸大学, 教育学部, 助教授 (00301169)
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| Keywords | 情報伝達 / 形の相補性 / RNA-ペプチド相互作用 / HIV Revタンパク / Rev-responsive element(RRE) / RSG1.2ペプチド / 化学縮合剤 |
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| Research Abstract |
本研究では、RNA-ペプチド間の形の相補性に基づいた配列情報の伝達が可能ではないかと考え、ペプチド鋳型上での特定のRNA配列の会合・縮合反応を試みた。モデル反応構築の枠組みとして、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)RevタンパクのRNA結合ドメインに相当する短いペプチド(Revペプチド)、および、Revの結合相手であるRev-responsive element(RRE)との複合体を用いた。また、Revペプチドよりも強くRREと結合する人工ペプチド(RSG-1.2)について検討した。
まず、RREをいくつかの特定の位置で切断した形のRNA断片を調製し、ゲル・シフト法によりこれらのRNA断片のRevおよびRSG-1.2との複合体形成を調べたところ、RSG-1.2の場合のみその形成が確認できた。そこで、次に、RSG-1.2ペプチド存在下でのRNA断片の縮合反応を化学縮合剤EDACを用いて行った。その結果、特にRREのペプチドとの結合ドメインである内部ループに隣接する位置での縮合反応は、ペプチドが存在しない場合と比較して大きく促進された。また、二つのRNA断片を繋ぎ止めているステム領域の相補性を無くすことにより、ペプチドが存在しない時の反応の効率が著しく低下し、その結果、反応の特異性(ペプチドの有無における反応の効率の割合)が向上した。
現在、反応の配列特異性を検討するため、1)HIVRREへのヌクレオチド置換を行い、RNA断片のHIV Revペプチドとの結合能の低下をゲルシフトによりモニターし、カップリング効率への影響を調べている。また、RNA上のどの位置でのカップリングが可能であるか明らかにするため、circular permutation analysisを行ない、ペプチドとの結合に影響しないRNA上の切断位置を解析している。
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[Publications] K. Harada and A.D. Frankel: "Screening RNA-binding libraries using a bacterial transcription antitermination reporter assay"in RNA-Protein Interaction Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 118, Humana Press. 118. 177-187 (1999)
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[Publications] 原田和雄: "新規RNA結合ポリペプチドの創製―コンビナトリアル・ライブラリーからの分子進化的スクリーニング"蛋白質核酸酵素. 44・9. 1572-1583 (1999)
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[Publications] S.A. Robertson, K. Harada, A.D. Frankel, nd D.E. Wemmer: "Structure determination and binding kinetics of a DNA aptamer-argininamide comples"Biochemistry. 39. 946-954 (2000)
