一分子観察によるF_1モーターの回転と酵素反応ステップの関係の解明

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11156210
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 宗行 英朗 東京工業大学, 資源化学研究所, 助手 (80219865)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野地 博行 科学技術振興事業団, 戦略的基礎研究生命活動のプログラムチーム13, 特別研究員
• Keywords: 一分子観察 / ATP合成酵素 / F_1-ATPase

Research Abstract

F_1モーターの回転機構を解明するために以下の研究を行った.
まず,結晶構造から,ヌクレオチドの有無によって大きく二面角が変化するアミノ酸残基を探し出した.それによると,ミオシンATPaseでヒンジ領域といわれている部分に対応する残基番号179-181のHis,Gly,Gly残基が大きな二面角の変化を起こすことがわかり,それをAlaに変異させた.この変異によりβサブユニットのヌクレオチド結合型のコンフォメーションが安定化し,何らかの影響が回転に現れると期待した。しかし結果はF_1-ATPaseに特徴的なADP・Mgによる特異的阻害状態を安定化する効果を示し,回転の頻度は低くしたが,回転に伴うトルクなどには目立った影響を与えなかった。安定化の度合いを阻害状態の安定性から見積もったところ,エネルギー的にはごく小さな変化が速度的には大きく表れているとの結論を得た.
次に触媒部位付近にTrpを導入した変異体でヌクレオチド結合とATP加水分解活性の関係を調べた.野生型の酵素にこのTrp変異を導入した変異体では,ATP結合と加水分解活性の間に必ずしも明瞭な関係が見られなかった.これは非触媒部位へのATP結合の影響によるものと考えて,非触媒部位を破壊する変異を更に加えて検討した.その結果,最大活性は3カ所の触媒部位に同時にATPが結合したときに得られることがより明澄に確認できた.
一方,非触媒部位を破壊した変異体で,回転を観察した.この場合,ADPによる特異的阻害が非常に強く,観察が困難であったのでさらにβT165S変異を導入した.その結果,ADPによる特異的阻害は回転が完全に停止した状態であること,それ以外にも小刻みな回転・停止状態があることがわかった.

Research Products

• [Publications] Eiro Muneyuki and Takaaki A. Fukami: "Properties of the stochastic energization-relaxation channel model for vectorial ion transport"Biophys. J. in press. 78 (3). (2000)
• [Publications] Tomoko Masaike, Hiroyuki Noji, Eiro Muneyuki, Rhyohei Yasuda, Kazuhiko Kinoshita Jr. and Masasuke Yoshida: "Rotation of F_1-ATPase and the hinge residues of the β subunit"J. Exper. Biol.. 203. 1-8 (2000)
• [Publications] Eiro Muneyuki, Hiroyuki Noji, Toyoki Amano, Tomoko Masaike and Masasuke Yoshida: "F_0F_1-ATP synthase ; general structural features of "ATP-engine" and a problem of free energy transduction"Biochem. Biophys. Acta in press. (2000)
• [Publications] Toyoki Amano, Tadashi Matsui, Eiro Muneyuki, Hiroyuki Noji: "α_3β_3γ Complex of F_1-ATPase from thermophilic Bacillus PS3 can maintain steady-state ATP hydrolysis activity depending on the number of non-catalytic sites"Biochem. J.. 343. 135-138 (1999)
• [Publications] Dirk Bold, Eiro Muneyuki, Toyoki Amano, Jochen Kruip. Toru: "The noncatalytic site-deficient α_3β_3γ subcomplex and F_0F_1-ATP synthase ca continuously catalyze ATP hydrolysis when Pi is present"Eur. J. Biochem.. 262. 563-568 (1999)
• [Publications] Daichi Okuno, Makoto Asumi and Eiro Muneyuki: "Chloride concentration dependency of the electrogenic activity of halorhodopsin"Biochemistry. 38. 5422-5429 (1999)
• [Publications] Satoshi P. Tsunoda, Eiro Muneyuki, Toyoki Amano, Masasuke Yoshida and Hiroyuki Noji: "Cross-linking of Two Subunits in the Closed Conformation in F_1-ATPase"J. Biol. Chem.. 274. 5701-5706 (1999)
• [Publications] Eiro Muneyuki, C. Shibazaki, H. Otani, D. Okubo, M. Asumi and T. Mogi: "Time-Resolved Measurements of Photovoltage Generation by Bacteriorhodopsin and Halorhodopsin Adsorbed on a Thin Polymer Film"J. Biochem.. 125. 270-276 (1999)