センチニクバエ由来NF-kB様転写因子5-kDa蛋白質のX線結晶構造解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11160205
• Research Institution: Nagaoka University of Technology
• Principal Investigator: 野中 孝昌 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (30242457)
• Keywords: SRAM / DNA結合蛋白質 / kB様配列 / Relホモロジードメイン / 核移行シグナル / アンキリンリピート / 転写因子 / センチニクバエ

Research Abstract

これまでにT7プロモータを含む発現ベクターにSRAMのORFを導入し、全長に続いてHis-Tag(His x6)をC末端側に付加したリコンビナント蛋白質を大腸菌により発現させた。このリコンビナントSRAM単独で結晶化条件の探索を試みたが結晶は得られなかった。DNA結合蛋白質の場合DNAとの共結晶化を行ったほうがよい結果を得られる場合が多いことが知られている。そこで、共結晶化に適したDNA配列を結合活性の強弱によって探索するため、各種kB様配列との結合活性をゲルシフトアッセイによって確認した。その結果kB様配列とSRAMとの結合ではGGGxxxxCCCという配列がGGGやCCCの部分が変化しているkB様配列に比べて結合活性が明らかに高いことがわかった。しかしながら、この全長で発現させたリコンビナントSRAMと結合活性の強弱を参考にして作製した様々なkB様配列を用いて共結晶化を行ったにもかかわらず結晶は得られなかった。そこで、V8(Glu-C)プロテアーゼおよびトリプシンによるSRAMの限定分解によりドメイン構造を調べた結果、Relホモロジードメインに続く核移行シグナルと、一つ目のAnkyrinリピートドメインとの間で分解され、それぞれのドメイン構造は分解されずに安定した構造をとっていることが分かった。この因子の特徴の一つにAnkyrinリピートを有したまま核移行する点があるが、今回の結果は核移行シグナルがAnkyrinリピートなどのC末端側の領域に覆い隠されていないことを示唆している。また、2つのドメイン構造を持っていることが結晶化の妨げとなっていると考えられることから、限定分解によって分解された部位を参考にしてT7プロモータによる発現系を用いたRelホモロジードメインのみのリコンビナントSRAMコンストラクトを作製した。しかし、リコンビナントSRAMの発現が確認できないことから、現在他のコンストラクトでの作製を試みている。

Research Products

• [Publications] Fujimoto, K., Ichinose, H., Nagatsu, T., Nonaka, T., Mitsui, Y. and Katoh, S.: "Functionally important residues tyrosine-171 and serine-158 in sepiapterin reductase"Biochim. Biophys. Acta. 1431(2). 306-314 (1999)
• [Publications] Taguchi, S., Ozaki, A., Nonaka, T., Mitsui, Y. and Momose, H.: "A cold-adapted protease engineered by experimental evolution system"J. Biochem.(Tokyo). 126(4). 689-693 (1999)
• [Publications] Matsumoto, T., Nonaka, T., Hashimoto, M., Watanabe, T. and Mitsui, Y.: "Three-dimensional structure of the catalytic domain of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 at a very high resolution"Proc. Japan Acad.. 75B. 269-274 (1999)