酵素免疫測定法の高感度化を目的とした酵素反応シンクロナイゼーション系の開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11167248
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• Keywords: 酵素免疫測定法 / 臨床診断 / 分子シンクロナイゼーション / 酵素反応 / 酵素活性 / 補酵素 / ダイオキシン / 分析化学

Research Abstract

酵素免疫測定法(EIA)は広く臨床診断に用いられているが、0.1mLの血清を用いて、1時間にattomoleレベルの測定が求められる。現状ではより好感度・迅速なシステムが求められている。本研究では簡便、迅速、高感度なEIAの開発を目的として、酵素反応シンクロナイゼーション系を構築しようとした。本システムはダイオキシンなどの環境汚染物質の測定にも利用できる。以下のような3酵素シンクロナイゼーション系を構築しようとした。アルカリホスファターゼ(ALP)でNADPをNADに変換し、このNADを用いてアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)によりエタノールをアセトアルデヒドへ変換する。このときNADはNADHへ還元される。ジアホラーゼ(DIA)よりNADHはNADへ酸化されるが、このときテトラゾリウム塩(TZ)を青色色素フォルマザンへ変換する。従来の酵素系では、ALPの活性に対し1当量の生成物しか生じないが、本システムでは、NADとNADH間の回転数に応じて、当量が増大する。3酵素シンクロナイゼーション系が効率よく回転し、最終産物であるフォルマザンが高収率で得られる反応条件を検討した。特に、3酵素の作用に最適なpH、温度、緩衝液組成、イオン強度、添加物濃度(グリセロール、金属、金属キレート剤)を検討した。その結果、100-200mMトリス・塩酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液、pH7-8、25℃、10mM EDTA、500mM程度のエタノール存在下で実施するのが効率的であることが明らかになった。また、可溶性フォルマザンを生じるTZは分光学的検出上便利ではあるが、不溶性(沈殿)フォルマザンを生じるTZの方が、3酵素反応系を回転させるのに有効であることが示された。

Research Products

• [Publications] K. Morimoto: "Method for the preparation of Bispecific F(ab') 2μ fragments of mouse monoclonal antibody ..."J. Immunol. Methods. 224・1. 43-50 (1999)
• [Publications] T. Sakaki: "Enzymatic properties of human 25-hydroxy vitamin D3 12-hydroxylase expressed in E col"Eur. J. Biochem.. 259. 731-738 (1999)
• [Publications] T. Sakaki: "Metabolic stuches using recamioinant E, coli cells producing rat mitochondrial cyp24"Eur. J. Biochem.. 262. 43-48 (1999)
• [Publications] N. Sawada: "Enzymatic properties of human 25 hydroxy vitamin 12-hydroxylase"Eur. J. Biochem.. 265. 950-956 (1999)
• [Publications] S. Kondo: "Electrostatic interaction between cytochrome P450 and NAPPH-P450 reductase"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 257. 273-278 (1999)
• [Publications] K. Inouye: "Inhibitory effects of vitamin A and vitamin K on rat cytochrome P450 1A1-dependent..."Biochem. Biophy. Res. Commun.. 262. 565-569 (1999)
• [Publications] 井上國世: "タンパク質の熱安定性の上限はどこにあるか?"化学と生物. 37・11. 738-739 (1999)
• [Publications] 井上國世: "好熱性プロティナーゼ、サーモライシンの好塩性と塩に依存する活性化の酵素化学"科学と工業. 73・11. 527-532 (1999)
• [Publications] T. Takita: "Lysyl-tRNA synthetase of Bacillns stearo-thermophilus molecular cloning and expression"Biosci. Biotechno. Biochem.. 64・2. 432-437 (2000)
• [Publications] 井上國世: "酵素化学的および物理化学的手法を用いる大豆たん白質"大豆たん白質研究. 2. 20-27 (1999)
• [Publications] S. Jinno: "Total synthesis of a natural antioxidant and structure-activity celationships"Chem. Pharm. Bull.. 47・9. 1276-1283 (1999)
• [Publications] S. Jinno: "Total synthesis of an antioxidant isolated from yeast via palladium-catalyzed"Bioorg. Med. Chem. Lett.. 9. 1029-1032 (1999)
• [Publications] H. Oneda: "Refolding and recovery of recombinant human matrix metalloproteinase 7"J. Biochem.. 126. 905-911 (1999)
• [Publications] A. Tanaka: "Guanidine hydrochloride-induced denafucation of pseudomonas cepacia lipase"J. Biochem.. 126. 382-386 (1999)
• [Publications] Y. Yamasaki: "Separation of amino acids and peptides by high-performance liquid chromatography"J. Liq. Chrom. Rel. Technol.. 22・13. 1965-1974 (1999)
• [Publications] S. Kitanaka: "No enzyme activity of 25-hydroxy vitamin D3 12-hydroxylase gene product in ..."J. Clin. Endocrinol. Metab.. 84. 4111-4117 (1999)
• [Publications] K. Adachi: "Relationship between the activity of glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase in hair follicles"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 63. 2219-2221 (1999)
• [Publications] M. Kubo: "Mechanism of thermostability in thermolysin-analysis of subsite 52 mutant"Lett. Appl. Microbiol.. 28. 431-434 (1999)
• [Publications] M. Okamoto: "Molecular steroidogenesis"Universal Academy Press, Inc., Tokyo. 442 (2000)