Ca-ATPaseの電子線・X線結晶解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11169205
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 豊島 近 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (70172210)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小川 治夫 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (40292726)
• Keywords: 能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / X線結晶解析 / ATPase

Research Abstract

最初の目標であったCa^<2+>-ATPaseの高分解能での構造決定はカルシウム結合時の構造に関して、2.6Å分解能で決定できた。これを踏まえ、本年度は(i)分解能の向上をはかることと(ii)脂質二重膜との関連を明らかにすることを目標とし、特に(ii)に重点を置いた。(i)に関しては、試料を室温にさらすことなく急速凍結できる装置を試用したところカルシウム非存在下の結晶においては非常に有効であり、作業能率も著しく向上することがわかった。また、(ii)の脂質二重膜の可視化の為には変化脂質や溶媒のコントラスト変調法を検討した。この2つの方法では得られる情報が異なるため、両方とも実行することを計画している。しかるにSpring-8でのデータ収集に関して、測定系が確立していないため、溶媒のコントラスト変調のみを実行した。コントラストを変えるためには、溶媒の密度を変える必要があるが、重原子による異常散乱効果も利用できるよう反応性の低い金チオグルコースを利用することをまず試みた。種々の濃度を試した結果、15%程度までしか上げられないことが判明した。一方、試料の安定化の為に用いているグリセロールの濃度を上げることも検討したが、結晶が壊れてしまうことが判明した。そこで、sucroseを用いたところ、30%まで結晶は破壊しないが、反射能は落ちることもわかった。さらに、結晶化の際に加えているPEGの濃度との関連も調べている。

Research Products

• [Publications] S.Danko: "Organization of cytoplasmic domains of sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase in E_1P and E_1ATP states : a limited proteolysis study"FEBS letters. 505. 129-135 (2001)
• [Publications] S.Danko: "ADP-insensitive phosphoenzyme intermediate of sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase has a compact conformaition resistant to proteinase K, V8 protease and trypsin"FEBS letters. 489. 277-282 (2001)
• [Publications] Z.Zhang: "The role of the M6-M7 Loop (L67) in stabilization of the phosphorylation and Ca^<2+> binding domains of the sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase (SERCA)"J. Biol. Chem.. 276. 15232-15239 (2001)
• [Publications] 豊島 近: "筋小胞体カルシウムポンプの構造決定"蛋白質・核酸・酵素. 46. 1374-1380 (2001)
• [Publications] 豊島 近: "カルシウムポンプの構造と能動輸送のメカニズム"現代化学. 365. 22-28 (2001)
• [Publications] 豊島 近: "筋小胞体カルシウムポンプの構造決定"日本放射光学会誌. 14. 42-48 (2001)