2000 Fiscal Year Annual Research Report
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11169233
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| Research Institution | Himeji Institute of Technology |
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Principal Investigator |
伊藤 恭子 (新澤 恭子) 姫路工業大学, 理学部, 助手 (70206316)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 栄樹 大阪大学, 蛋白質研究所, 助手 (00294132)
吉川 信也 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40068119)
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| Keywords | チトクロム酸化酵素 / X線結晶構造解析 / 反応中間体 |
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| Research Abstract |
チトクロム酸化酵素は酸化還元中心を介した電子伝達機能、酸素還元反応及びミトコンドリア内膜をこえるプロトンの輸送機能をもつ。これら反応機構を明らかにするには酸化型酵素だけでなく還元型及び反応中間体酵素の最終的には水素の原子座標を求めることができるほど高分解能のX線結晶構造が必要となる。
低温X線回析実験は、高分解能データ収集に有効であり、また反応中間体を低温で固定して構造解析するためにも不可欠な手法である。これまでに酸化型結晶の2.0Å分解能での回析データを得ることに成功しているが再現性に乏しかった。そこで凍結方法、不凍剤の種類、不凍剤の導入の仕方等を詳細に検討した。その結果、これまで用いていたグリセロールの代わりに不凍剤としてエチレングリコールを用い、段階的に35%まで上昇させ、クライオ装置の気流による凍結を行うこととした。このようにすると再現性よく1.8Å以上の反射を示すとともに凍結結晶間で同型性が得られるようになった。酸化型結晶に関しては、SPring-8において1.65Å分解能の回析点が確認され、1.8Å分解能でのX線結晶構造解析を行っている。
反応機構を理解する上で不可欠な反応中間体については、反応溶液中に浸した結晶の吸収スペクトルを追跡しながらP型及びF型酵素を捕捉しX線回析データの収集を行った。P型については1.86Å分解能での、F型については2.0Å分解能でのX線回析データの収集に成功し、現在解析を進めている。
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